人核糖核酸酶抑制因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含有人核糖核酸酶抑制因子（hRI）基因的重组腺病毒载体。方法以含有全长cDNA的pT7-RI为模板,PCR扩增hRI,经T载体克隆后,酶切亚克隆到穿梭质粒pAdTrack—CMV上,在BJ5183细菌内和pAdEasy-1同源重组。筛选阳性克隆,酶切、PCR及测序鉴定,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增。通过观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果酶切鉴定及PCR结果证明hRI基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度为1．5×10^10 pfu/ml。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含hRI基因的重组腺病毒载体。     

携带siSPK1重组腺病毒的构建及其对N2a细胞凋亡的影响

应用AdMax腺病毒载体系统构建携带siSPK1基因的重组腺病毒,进一步研究SPK1基因对N2a细胞凋亡的影响。设计可形成小发夹结构的SPK1-siRNA模板cDNA序列,克隆至质粒pDC316-siRNA,构建SPK1-siRNA穿梭质粒pDC316-SPK1,经鉴定正确后,将pDC316-SPK1与辅助包装质粒（pBHG loxΔE1,3 Cre）共转染至HEK293细胞,包装纯化并扩增重组腺病毒颗粒,终点稀释法测定病毒滴度;病毒感染N2a细胞,Western blot法检测SPK1蛋白的表达;Hoechst33258染色检测SPK1基因对N2a细胞凋亡的影响。酶切后PCR分析、测序鉴定表明,pDC316-SPK1构建成功,病毒纯化后滴度为2.50E＋10 PFU/mL;重组病毒可在蛋白水平抑制SPK1的表达;SPK1基因抑制后,N2a细胞凋亡增加（P〈0.001）。上述结果表明,含有SPK1-siRNA的重组腺病毒构建成功,且具有抑制SPK1蛋白表达的功能,该基因沉默后,N2a细胞凋亡增加。     

小鼠SOCS1基因重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞中的表达

目的:构建含小鼠细胞因子信号抑制因子-1基因(SOCS1)的重组腺病毒载体(Ad5F35-SOCS1),探讨其介导SOCS1基因在小鼠树突状细胞中的表达。方法:设计含AgeI和NheI酶切位点的SOCS1基因上下游引物,以质粒pEF-FLAG-1/mSOCS1为模版,通过PCR扩增获得SOCS1全部序列,片段回收后经AgeI和NheI酶切,再定向插入到经AgeI和NheI酶切的质粒pDc316-LacZa中,获得重组穿梭质粒pDC316-SOCS1,经AgeI和NheI酶切、PCR及测序等鉴定后,用脂质体将穿梭质粒pDC316-SOCS1与腺病毒骨架质粒pBHGF35共转染293细胞,经位点特异性重组获得重组腺病毒Ad5F35-SOCS1,行PCR鉴定,经293细胞扩增、纯化制备高滴度病毒液,TCID50法测定病毒滴度。用获得的重组腺病毒感染小鼠树突状细胞,以免疫组化检测SOVD1的表达。结果:成功构建了含小鼠SOCS1基因的重组腺病毒载体,病毒感染滴度为1.4×10~9IU/ml,该载体能有效介导SOCS1基因在小鼠树突状细胞中的表达。结论:重组腺病毒载体能将SOCS1基因转入小鼠树突状细胞并有效表达,为基因转染制备耐受性树突状细胞奠定了基础。     

脂肪储存小滴蛋白5重组腺病毒的制备

目的：利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5（LSDP5）基因的重组腺病毒。方法：从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果：LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论：成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(MSC)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗DMD疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5·58×1012vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdxMSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdxMSCs进行同种异体移植治疗DMD疾病奠定了基础。     

FMDV全ORF编码基因的克隆及其腺病毒载体的构建

为研制O型口蹄疫病毒(FMDV)复制缺陷型腺病毒活载体疫苗毒株,通过RT-PCR方法获得了O型FMDV的开放阅读框(ORF)基因,并定向克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建了重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMVORF,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆得到的ORF编码基因序列与原始强毒株O型FMDV的ORF编码基因相似性达99.8%。将含有目的基因的穿梭质粒线性化后和腺病毒骨架载体pAdeasy-2共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细胞中,得到重组腺病毒质粒pAd-ORF,经PCR和酶切鉴定正确。本研究成功获得了含有现代O型疫苗用FMDV毒株的全ORF编码基因的阳性克隆,并成功构建了含有完整编码基因表达盒的重组腺病毒穿梭质粒及其腺病毒骨架质粒。     

H5N1禽流感病毒HA和NA基因重组腺病毒共表达载体的构建

利用口蹄疫病毒(FMDV)2A蛋白具有自我裂解的功能,将其作为连接肽构建携带有H5N1亚型AIVHA和NA基因的重组腺病毒表达载体,进而为AIV基因工程疫苗的开发以及相关诊断试剂的开发提供依据。采用融合PCR的方法扩增出含有H5N1 AIV HA-2A-NA的基因,定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA,将pAdeasyd-H5经PacI线性化后转染HEK293细胞株包装出含有HA-2A-NA基因的腺病毒pAd-HA-2A-NA。结果表明,构建的含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA经PCR、双酶切及核苷酸测序测定无误。线性化后的pAdeasy-HA-2A-NA转染HEK293细胞包装成功获得腺病毒pAd-HA-2A-NA载体,经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。本试验构建的含有AIV H5N1亚型HA-2A-NA基因的重组腺病毒表达载体,将为进一步研究开发基因工程疫苗提供病毒模型。     

人成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc及其突变型重组腺病毒的获得和在乳腺癌细胞中的表达

获得人成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc(FGFR2Ⅲc)及其S252W突变型重组腺病毒,感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,为下一步研究FGFR2Ⅲc基因的功能和作用机制奠定基础。以本实验室保存的含FGFR2Ⅲc基因的质粒为模板,PCR扩增得到FGFR2Ⅲc基因,重叠延伸法PCR获得FGFR2ⅢcS252W突变型基因;分别将上述野生型和突变型基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,得到重组穿梭质粒pAdTrack-FGFR2Ⅲc和pAdTrack-FGFR2ⅢcS252W,DNA测序证实。Pme I酶切后分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ-5183感受态细菌同源重组,得到的重组表达质粒Ad-FGFR2Ⅲc和Ad-FGFR2ⅢcS252W Pac I酶切线性化后转染HEK293A细胞进行重组腺病毒的包装和扩增,通过GFP报告基因观察病毒表达情况。收集重组病毒颗粒并测定滴度,进一步感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,RT-PCR和Western blotting方法检测目的基因的表达,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法和流式细胞术分析细胞增殖情况。结果表明,成功构建了人FGFR2Ⅲc及其S252W突变型基因的重组腺病毒表达载体,获得的重组腺病毒颗粒能高效感染MDA-MB-231细胞,并表达目的基因。MTT结果显示FGFR2Ⅲc和S252W均能抑制MDA-MB-231细胞增殖,S252W抑制效果更加明显。流式细胞术表明FGFR2Ⅲc和S252W均能使MDA-MB-231细胞周期停滞于G0/G1期,抑制细胞增殖。     

含人β-内啡呔融合基因的腺病毒/腺相关杂合病毒载体的构建与鉴定

目的:构建含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒。方法:构建腺病毒穿梭质粒pDC312-DTREE,与骨架质粒共转染HEK293细胞,细胞内同源重组包装出腺病毒腺相关杂合病毒。PCR法鉴定病毒及TCID50法测定病毒滴度。杂合病毒感染NIH3T3细胞观察转基因的表达,ELISA法测定表达产物浓度。结果:穿梭质粒pDC312-DTREE经限制性核酸内切酶AatII及NotI酶切结果正确。PCR鉴定结果表明病毒DNA内有人β-内啡呔DNA序列,且无野生型病毒的污染,病毒滴度为1.29×1010PFUml。病毒感染细胞后第3d,细胞培养液内有高浓度的β-内啡呔。结论:成功构建了含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒,为进行下游相关研究奠定了基础。     

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术,将目的基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack—CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5a;筛选出重组质粒pAdTrack—CMV—HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pad—HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad—HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT—PCR、Western印迹鉴定外源基因HAX1的表达。BrdU检测感染了Ad—HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况。结果pAdTrack—CMV—HAX1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—HAX1质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符。构建好的Ad—HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达。HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高。结论成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖。     

犬瘟热病毒核蛋白基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达

核蛋白基因(N)位于犬瘟热病毒基因组的108-1679位置处,是保守性较强的免疫原性蛋白,因此选择N基因作为目的基因,利用酶切、连接等方法构建了含犬瘟热病毒核蛋白基因的穿梭质粒pVAXAE3LPN.以含CAV-2 SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建了重组质粒pCAV-2-CDVLPN,利用脂质体介导法转染MDCK细胞,转染三次后,细胞出现了典型的腺病毒样病变.电镜负染、切片观察,酶切、PCR.扩增及测序鉴定的结果表明表达犬瘟热核蛋白基因的重组犬2型腺病毒构建成功,表达的核蛋白分子量为58kDa.     

脂肪储存小滴蛋白5 重组腺病毒的制备

目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒。方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

eIF-4E腺病毒载体构建及对乳腺癌MCF-7细胞转移能力的影响

摘要 目的：构建乳腺癌真核细胞起始因子一4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF-4E)基因重组腺病毒载体,并观察其对乳腺癌细胞MCF-7转移能力的影响。方法：应用基因重组技术将eIF-4E基因构建于腺病毒载体pAD-X,转染293包装细胞得到高滴度重组腺病毒,并用real-time PCR进行eIF-4E基因表达的验证。将重组腺病毒pAD-eIF-4E感染MCF-7细胞后,应用transwell小室法观察其对细胞侵袭和运动能力的影响。结果：酶切结果与预期相符,real-time PCR可检测到转染后MCF-7细胞有eIF-4E基因表达。且病毒转染后transwell小室可见,MCF-7细胞的侵袭和运动能力均受到显著的抑制（均为p<0.01）。结论：重组eIF-4E腺病毒载体正确构建,其对乳腺癌细胞MCF-7的侵袭和运动都有抑制作用。     

高糖应激致人PRKCD基因过表达内皮细胞模型构建及鉴定

目的:构建高糖应激下人PRKCD基因过表达内皮细胞模型并鉴定。方法:设计含AgeⅠ和NheⅠ酶切位点的PRKCD基因上下游引物,以含PRKCD基因的原始质粒为模版,PCR扩增获得PRKCD全部序列,经AgeⅠ和NheⅠ酶切后与同样酶切后的真核表达载体pDC316-LacZα重组获得穿梭质粒pDC316-PRKCD,经PCR及酶切、基因测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pB-HGlox△E1,3Cre共转染293细胞获得重组腺病毒Ad5-PRKCD,行PCR鉴定并反复纯化扩增后用TCID50法测定病毒滴度。分组培养人脐静脉内皮细胞,转染重组腺病毒后于高糖(25mmol/L)负荷,并设立空载体对照及渗透压对照组,以免疫荧光法检测PKCδ在细胞中的表达。结果:目的基因成功插入穿梭质粒,基因测序结果与GenBank公布序列一致,重组腺病毒Ad5-PRKCD经PCR鉴定及免疫荧光鉴定成功。测得病毒滴度为1.0×1010IU/ml。激光共焦聚观察高糖负荷下,胞内PRKCD翻译产物PKCδ荧光表达强度明显增强,为正常对照组的1.5倍(P0.05),高糖负荷下内皮细胞感染重组腺病毒后PKCδ荧光强度明显增加,浆/核荧光强度比值较高糖组进一步降低了35%(p0.05),提示核转位明显。结论:成功构建了人重组腺病毒Ad5-PRKCD并有效转染人脐静脉内皮细胞,高糖负荷使PKCδ表达上调并发生核转位激活,为筛选稳定表达PKCδ的内皮细胞株及其蛋白复合体奠定了基础。     

荧光素酶标记的重组人3型腺病毒的构建及分析

人3型腺病毒在人DSG2受体转基因鼠体内复制及侵染等生命过程尚不清楚。本研究旨在构建含萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase,Fluc)报告基因的复制型重组人3型腺病毒,为可视化重组人3型腺病毒的应用奠定基础。通过PCR扩增萤火虫荧光素酶报告基因,克隆入去掉EGFP基因的人3型腺病毒穿梭质粒pSKA3E3LR(EGFP),经双酶切后与人3型腺病毒骨架质粒pBRAd3-EGFP的PCR扩增片段经重组酶Exnase体外重组的方法,得到中间载体,最后与pBRAd3-EGFP酶切片段连接,得到重组腺病毒质粒pAd3-LUC;转染AD293细胞,将包装成功的重组腺病毒rAd3-LUC纯化并免疫动物,分析重组腺病毒的特性和在小鼠体内的免疫反应。结果显示采用体外重组、酶切连接等方法成功获得到重组人3型腺病毒质粒pAd3-LUC,线性化的pAd3-LUC转染AD293细胞包装拯救得到重组腺病毒rAd3-LUC,观察到细胞病变和检测到荧光素酶的稳定表达,rAd3-LUC免疫小鼠抗血清可以识别并中和重组腺病毒rAd3-LUC(滴度约128～256)。本研究成功构建了E3区缺失并嵌入荧光素酶的复制型重组人3型腺病毒rAd3-LUC,为监控人3型腺病毒在人DSG2受体转基因小鼠体内复制及侵染等生命过程奠定基础。     

小鼠CCR7基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的:构建含有小鼠趋化因子受体-7(CCR7)基因的重组腺病毒,为下一步转染不成熟树突状细胞(imDC)诱导免疫耐受研究奠定基础。方法:提取小鼠胸腺总RNA,应用逆转录PCR(RT-PCR)方法,以自行设计的带有酶切位点的引物,扩增获得CCR7基因全部序列,经过T-A克隆,酶切亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,在BJ5183菌内和pAdeasy-1同源重组,筛选阳性克隆,酶切鉴定,线性化后脂质体法转染HEK293细胞进行包装、PCR鉴定及扩增,得到含有CCR7基因的重组腺病毒,根据报告基因GFP测定病毒滴度。结果:成功构建小鼠CCR7基因重组腺病毒,病毒滴度为1×10~9U/mL。结论:该重组腺病毒载体的成功构建,为进一步研究携带CCR7基因的imDC的趋化迁移性等研究提供了一定的工作基础。     

人RARα基因重组腺病毒表达质粒的构建及其对人白血病NB4细胞的影响研究

利用AdEasy系统构建携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染人白血病NB4细胞后用生理浓度的维甲酸诱导,观察其对NB4细胞增殖和分化的影响。以急性早幼粒细胞株NB4的cDNA为模板,PCR扩增RARα基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα。用EcoR V和Sal I双酶切及测序鉴定,然后与骨架质粒AdEasy-1同时转化大肠杆菌BJ5183菌株的感受态,经同源重组获得重组腺病毒质粒Ad-RARα。酶切验证后,Pac I酶线性化后转染AD293细胞,包装出重组腺病毒Ad-RARα,经3轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。流式细胞术测定病毒感染效率,Western blot法检测重组腺病毒感染的人NB4细胞中RARα蛋白和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达,CCK-8法检测重组腺病毒感染对NB4细胞增殖的影响,Annexin V/PI双染法测定细胞周期,PI测定细胞凋亡。重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα经双酶切及测序证明构建正确,病毒感染效率可达70%,与空载体感染及未感染的NB4细胞相比,重组腺病毒感染的NB4细胞内RARα蛋白的表达明显升高(P0.05),且经生理浓度全反式维甲酸ATRA处理后,能够有效地促进感染重组腺病毒细胞的分化成熟和凋亡。该研究成功构建了携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染NB4细胞后可促进细胞增殖,经生理浓度维甲酸诱导后能促进NB4细胞分化成熟和凋亡,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。     

人Stathmin基因siRNA腺病毒载体的构建及病毒鉴定

目的:为了寻求解决非特异性杀伤作用的星形细胞瘤的基因治疗问题的新途径.本研究构建带有Stathmin siRNA的复制缺陷腺病毒载体并包装病毒.方法:(1)两个目标siRNA基因片段合成并分别插入pSilencer4.1-CMV载体中从而构建两个重组真核表达栽体:pSilencer4.1-CMV-S1和pSilencer4.1-CMV-S2.(2)用EcoR Ⅰ和BamH Ⅲ双酶切pSilencer4.1-CMV-S1和pSilencer4.1-CMV-S2,将目的片段分别装进穿梭质粒,从而构建pShuttle-CMV neo-S1和pShuttle-CMV neo-S2.以独特的限制性内切酶PI-Sce Ⅰ合I-Ceu Ⅰ双酶切这两个穿梭质粒并重组至骨架Adeno-XTM Viral DNA上.并以PCR方法来鉴定.(3)线性化Ad-pShuttle-CMV neo-S1和Ad-pShuttle-CMV neo-s2并转染入HEK293细胞,出毒后进行PCR毒种鉴定和滴度分析.结果:(1)酶切分析和DNA测序表明,小干扰RNA片段的成功连接到pSilencer4.1-CMV载体上分别.(2)酶切分析表明两个目的基因片段,都分别成功连接入穿梭载体pShuttle.PCR表明pShuttle-CMV neo-S1和pShuttle-CMV neo-S2分别与骨架重组成功.(3)腺病毒DNA进行PCR鉴定后表明成功地在体外重组并生产出腺病毒.且冻融产毒细胞保证了较高的重组腺病毒滴度.结论:Adeno-XTM系统是一个能简单而有效生产能表达目的基因腺病毒的系统.我们构建的腺病毒有望成为星形细胞瘤新的高效而安全的治疗方法.     

Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(ＭＳＣ)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗ＤＭＤ疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5.58×10¹²vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdx MSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdx MSCs进行同种异体移植治疗ＤＭＤ疾病奠定了基础。     

含人CCR5Delta32基因重组慢病毒的包装及滴度测定

目的：包装含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒并测定其滴度,用于获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的基因治疗研究。方法：从CCR5Deha32突变个体外周血单个核细胞（PBMC）中提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Deha32全长基因,经EcoRI单酶切后与pUCm—T载体连接,随后转化EcoliDH5ct,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序;将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6／V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析;用pLP1、pLP2、pLP／VSVG及pLenti-CCR5Delta32等4种质粒共转染293T细胞,产生重组慢病毒并测定其滴度。结果：克隆出人CCR5Deha32基因,并构建了含该基因的重组慢病毒载体,经293T细胞包装后产生5×10^5TU／mL的重组慢病毒。结论：高滴度含人CCR5Deha32基因重组慢病毒的包装,为进一步的AIDS基因治疗研究奠定了基础。