大鼠胰岛分离条件的优化

目的:优化大鼠胰岛分离纯化的条件,为胰岛移植实验奠定基础。方法:通过胆总管灌注胶原酶P来消化大鼠胰腺,分离胰岛,采用不连续密度梯度Ficoll离心法纯化胰岛,观察胶原酶浓度、消化时间以及大鼠体重对胰岛分离结果的影响。双硫腙染色鉴定胰岛,丫啶橙/碘丙啶染色鉴定胰岛细胞活率,糖刺激胰岛素释放试验评价胰岛功能。结果:胶原酶浓度、消化时间以及大鼠体重对胰岛分离结果有重要影响。1mg/ml胶原酶P在37℃静止消化45分钟条件下,胰岛分离效果最佳,效果较其他酶浓度和消化时间条件下好(P＜0．05)。体重350g的大鼠的胰岛收获量778．33±80．21IEQ/胰腺,而体重250g的大鼠的胰岛收获量655．00±56．56 IEQ/胰腺(P＜0．05)。优化条件下分离的胰岛其纯度＞90%,胰岛细胞活率＞90%,低糖(2．8mmol/L)、高糖(16．7mmol/L)刺激胰岛素释放分别为(5．40±1．75)mIU/L/30IEQ,(12．27±2．55)mIU/L/30IEQ(P＜0．05),刺激指数为2．33±0．29。结论:胶原酶浓度、消化时间以及大鼠体重影响胰岛分离结果,优化分离条件可改善大鼠胰岛分离结果。     

菠菜细胞色素b6f复合体中单线态氧的产生和清除机制（英文）

采用自旋捕捉电子顺磁共振技术研究了强光诱导下菠菜Cyt b6f中单线态氧(1O2*)产生和清除的分子机制,结果表明:在强光照射和有氧条件下,缺失Rieske Fe-S蛋白的Cytb6f和分离的Rieske Fe-S蛋白溶液中都检测到1O2*的产生,这证明Chla和Rieske Fe-S蛋白都是菠菜Cytb6f中光诱导1O2*产生的位点,而Chla是1O2*产生的主要部位。采用波长为675 nm的红光选择性激发Cytb6f中的Chla时,也检测到1O2*的产生,进一步支持了上述结论。此外,外加天然抗氧化物质,如抗坏血酸、谷胱甘肽、L-组氨酸和β-胡萝卜素,可清除系统中产生的1O2*。这很可能是菠菜Cytb6f中一种保护底物抵抗单线态氧光氧化的保护机制。     

一种快速构建集胞藻6803petBD必需基因定点突变株的方法

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中心体异常在咖啡因增强顺铂杀伤人肝癌细胞系中的作用

为了探讨咖啡因是否影响细胞周期检验点而增强顺铂杀伤肿瘤细胞及其作用机制 ,选取同步化于S期的肝癌细胞系SMMC 772 1,用顺铂和咖啡因进行不同方式的处理 ,包括顺铂处理、咖啡因处理以及先经顺铂 ,再用咖啡因处理 .利用相关方法对不同处理的细胞进行了分析 ,包括细胞形态 ,细胞生长速率 ,多核细胞的形成与死亡 ,中心体的异常等 .结果显示 ,顺铂与咖啡因联合处理的细胞出现明显的多核化现象 ,多核细胞占总细胞的百分比可以达到 30 %以上 ,高于用顺铂或用咖啡因处理的细胞 .同时观察到多核细胞生存能力较差 ,它们会通过细胞凋亡的形式死亡 .抗中心体人自身免疫血清的免疫荧光结果显示 ,中心体异常与多核细胞的形成直接相关 .在部分多核细胞的核周围有多个不同强度的荧光点 ,在另部分多核细胞中 ,在其中央有一个大的荧光点 ,被多个细胞核围绕 ,荧光较强 .根据结果推测 ,由多个不完整的中心体导致的多极分裂形成多核细胞 ,随后多个中心体聚集到中央形成大的中心体 ,负责间期微管的组装 .结果表明 ,受到顺铂损伤的细胞由于检验点的作用而使细胞周期阻断 ,咖啡因可消除周期的阻断 ,使细胞在中心体未完成正常复制状态下进入有丝分裂 ,产生大量多核细胞 ,这些多核细胞最终发生凋亡 .     

鸡粪好氧堆肥过程中细菌群落结构和功能分析

为了明确鸡粪好氧堆肥过程中细菌群落结构和功能的变化,采用高通量测序技术测定了好氧堆肥前、中、后3个时期样品的16S rRNA基因序列,并进行了生物信息学分析。结果表明, 3个堆肥阶段中仅有10%左右的分类操作单元(operational taxonomic units, OTUs)具有阶段特异性;不同发酵阶段细菌α多样性指数ACE、Chao1和Simpson均呈现先升高后降低的趋势,但各阶段间差异不显著(P<0.05)。3个发酵阶段优势菌门类相同,但丰度存在差异。线性判别分析[line discriminant analysis (LDA) effect size, LEfSe]法对细菌生物标志分析表明,从门到属水平共有49个物种,堆肥前期样品组中显著富集的物种最多,后期最少。原核分类群功能注释(functional annotation of prokaryotic taxa,FAPROTAX)对细菌功能多样性分析表明,堆肥前期细菌功能多样性最高,而随着发酵进行细菌功能富集程度增加、多样性降低。该研究为畜禽粪污好氧堆肥过程调控提供理论支撑和技术指导。     

香石竹设施栽培根际土壤微生物区系的16S rRNA系统遗传多样性

【目的】针对香石竹设施栽培土传病害的生物防治技术研究,探讨其根际土壤微生物与枯萎病害的关联性。【方法】采集香石竹健康植株与枯萎病植株根际土壤,采用不同培养基进行分离、纯化,并对分离菌株提取基因组DNA,用其16S rRNA序列的通用引物进行PCR扩增,进行blast同源分析。【结果】从采集样品中分离出的菌株分布于细菌域(Bacteria)中的4个门(Phyla)共15个属(Genera),其中从健康植株组土壤中培养出65株菌,分布于9个属,并以芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)及孢霉菌(Mortierella)为优势菌群;而枯萎病株组土样共培养出33株菌,分布于12个属,并且寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、金黄杆菌(Chryseobacterium)、拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis)及尖镰孢病原菌(Fusarium oxysporum)属的分离菌株仅从病株组土壤中分离到;分离菌株同源性在90%-98%的潜在新种(potential novel species)有13株。【结论】研究结果表明,根际土壤中真菌数与总菌数的百分比或Bacillus类群多样性的丰度,可作为评价区域香石竹种植土壤健康状况、栽培土壤演变及病害防治预测预报的参考指标。     

对氢键网络的干扰降低细胞色素b_6f复合体中Chla的光稳定性

细胞色素b6f蛋白复合体(Cyt b6f)参与光合膜上电子传递和跨膜质子转移,在体内以二体形式存在,每个单体只结合1分子叶绿素a(Chla).该Chla性质独特,光照条件下十分稳定,是甲醇中游离Chla的120~130倍,然而其光稳定性的机制仍未彻底阐明.Cyt b6f 2.7的晶体结构显示,Chla中心的Mg离子和H2O分子配位,并且该H2O分子通过氢键与复合体亚基Ⅳ的氨基酸G136和T137相互作用.本研究基于这一结构特点,对上述2个氨基酸进行了定点突变,以干扰、破坏氢键网络.结果发现,突变不仅导致蛋白与Chla结合能力下降,而且显著降低了Chla的光稳定性,这一结果表明,Cyt b6f中Chla相关的氢键网络对其稳定性具有重要的作用.     

小鼠SOCS1基因重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞中的表达

目的:构建含小鼠细胞因子信号抑制因子-1基因(SOCS1)的重组腺病毒载体(Ad5F35-SOCS1),探讨其介导SOCS1基因在小鼠树突状细胞中的表达。方法:设计含AgeI和NheI酶切位点的SOCS1基因上下游引物,以质粒pEF-FLAG-1/mSOCS1为模版,通过PCR扩增获得SOCS1全部序列,片段回收后经AgeI和NheI酶切,再定向插入到经AgeI和NheI酶切的质粒pDc316-LacZa中,获得重组穿梭质粒pDC316-SOCS1,经AgeI和NheI酶切、PCR及测序等鉴定后,用脂质体将穿梭质粒pDC316-SOCS1与腺病毒骨架质粒pBHGF35共转染293细胞,经位点特异性重组获得重组腺病毒Ad5F35-SOCS1,行PCR鉴定,经293细胞扩增、纯化制备高滴度病毒液,TCID50法测定病毒滴度。用获得的重组腺病毒感染小鼠树突状细胞,以免疫组化检测SOVD1的表达。结果:成功构建了含小鼠SOCS1基因的重组腺病毒载体,病毒感染滴度为1.4×10~9IU/ml,该载体能有效介导SOCS1基因在小鼠树突状细胞中的表达。结论:重组腺病毒载体能将SOCS1基因转入小鼠树突状细胞并有效表达,为基因转染制备耐受性树突状细胞奠定了基础。     

大肠杆菌甘露糖异构酶(MI)基因克隆及功能研究

甘露糖异构酶(EC 5.3.1.7,Mannose isomerase,简称MI)能够催化果糖和甘露糖之间的异构转化.甘露糖加氢催化形成甘露醇,因此甘露糖异构酶的研究为工业生产甘露糖和甘露醇提供了新的可能途径.本研究以Escherichia coli JM109基因组DNA为模板,PCR扩增mi基因.结果表明,所克隆的mi基因与E.coli str.K-12 substr.MG1655的MI基因序列一致性为99.9%,氨基酸序列一致性为99%.该基因能够在E.coli BL21(DE3)中进行高效诱导表达,诱导出51.4 kD的特异性融合蛋白.酶学研究表明,该酶最适反应温度为37℃,最适pH为7.5,甘露糖为最佳反应底物,反应平衡时果糖与甘露糖的比值约为2.7.     

去垢剂DDM和β-OG对细胞色素 b6f蛋白复合体中叶绿素a单线激发态寿命的不同影响

据报道, 细胞色素b₆f蛋白复合体(cytochrome b₆f, Cyt b₆f)中叶绿素a (chlorophyll a, Chl a)分子的单线激发态寿命(或荧光寿命)短于甲醇中游离Chl a的单线激发态寿命(~4 ns), 但是文献报道不同来源的Cyt b₆f中Chl a单线激发态寿命并不一致(一种为200 ps左右, 一种结果为600 ps左右). 本研究证明, 不同来源Cyt b₆f中Chl a的单线激发态寿命测定结果的不同, 与Cyt b₆f来源无关, 而与溶解膜蛋白的去垢剂—八烷基葡萄糖苷 (n-Octyl β-D-glucopyranoside, β-OG)和十二烷基麦芽糖苷(n-Dodecylβ-D-maltoside, DDM)有关. 溶解在DDM中的样品和溶解在b-OG中的样品相比, 其Chl a的荧光产率低, 强光照射下抗光破坏的能力强, 单线激发态的寿命更短(~200 ps). 显然, 溶解在DDM中样品的Chl a单线激发态的寿命更接近体内真实的情况.