β-葡萄糖苷酶的糖耐受和促活性质研究

【目的】以葡萄糖耐受并促活的β-葡萄糖苷酶Bgl2A为出发材料,寻找与β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受和促活性质相关的重要氨基酸残基位点并对其进行突变;对突变酶性质进行检测,结合分子对接,探究突变对酶的糖耐受和促活性质的影响及机制;进而对葡萄糖不耐受的Bgl3A (Bgl2A:A22S/V224S)进行分子改造,以获得应用潜能更好的突变酶。【方法】通过序列和结构比对、统计耦联分析和结构分析,选取Bgl2A底物通道口、蛋白质表面以及活性中心附近可能间接影响葡萄糖耐受和促活性质的残基作为突变位点,构建了多个突变酶,并对其酶学性质进行检测。【结果】以Bgl2A为出发酶,D322I、W325A、W126Y、F172N、C173I和N226V的糖耐受和促活性质显著提升。分子对接提示,这些突变可能是通过变构效应影响活性中心与葡萄糖结合的自由能,从而改变酶葡萄糖耐受和促活性质。据此,在Bgl3A分子上对应构建多个突变体,筛选获得了较出发酶在糖耐受和促活性质提升的同时保持较高酶活和稳定性的突变酶N226V和F172N。【结论】除了酶与葡萄糖直接结合的位点,不与葡萄糖直接相互作用的位点也可通过远程作用间接影响...     

海枣曲霉β-葡萄糖苷酶的催化性质

本文研究了海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)β-葡萄糖苷酶的底物特异性以及不同化学试剂对酶活力的影响。该酶水解对一硝基酚基-β-葡萄糖苷、纤维二糖和水杨素的相对活力分别为100、180和67.3。水解对一硝基酚基β-葡萄糖苷和纤维二糖的Km值分别为0.97mmol／L和1 8mmol／L,Vmax分别为576μmol min-1.mg-1和595μmol.min-1.mg-1.mg-1。Ag+、D-葡萄糖和纤维二糖对酶活力有强烈的抑制作用。Lineweaver—Burk作图法及Dixon作图法表明D-葡萄糖对该酶显示竞争性抑制作用,其Ki值分别为30mmol／L和3．4mmol／L。     

随机突变提高单胺氧化酶活性

前期获得了一个对底物美西律具有一定活性的单胺氧化酶突变体A-1(F210V/L213C)。为进一步提高其酶活性,利用MegaWHOP PCR构建了库容约为104的随机突变库。筛选后获得了一个最优突变酶ep-1,比活力为A-1的189%。选择性测定结果表明,酶的对映体选择性有较大提高,E值由101提高到282;动力学常数测定揭示,酶催化效率有较大提高,kcat/Km由0.001 51 mmol/(L?s)提高到0.002 89 mmol/(L?s)。和A-1酶相比,在所测定的11种胺类底物中,ep-1对其他7种底物的比活力有较明显提高,对其他4种底物的比活力变化不大。序列分析表明,ep-1的突变为T162A。分子动力学模拟结果提示,该突变主要通过修正通道氨基酸的二级结构和扩大活性口袋来发挥作用。     

F43Y及I354M,L358F定点突变对植酸酶热稳定性及酶活性的改善

对重组酵母PPNPm8的植酸酶phyAm基因进行PCR介导的定点突变,即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y),将其354、358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(I354M,L358F),得到了2个突变体PPNPm-1(F43Y)及PPNPm-2(I354M,L358F).含突变基因的重组表达载体pPIC9kphyAm-1,pPIC9kphyAm-2在毕赤酵母GS115中表达,对表达产物进行酶活性测定及热稳定性检测.结果表明:突变体PPNPm-1最适反应温度比未突变体PPNPm8上升了3℃,75℃处理10min,热稳定性提高15%,比活力提高11%;PPNPm-2最适反应温度未改变,热稳定性比PPNPm8仅提高3%,比活力降低6.5%.对突变前后的植酸酶空间结构进行比较预测,发现突变氨基酸Tyr43与空间位置相邻的Asn416之间形成氢键,增强了酶的热稳定性.     

嗜热酯酶APE1547催化活性的定向进化研究

对来源于嗜热古菌Aeropyrum pernix的酯酶(APE1547)催化活性进行定向进化研究。利用APE1547特殊的稳定性,建立了准确的高通量高温酯酶筛选方法。对第一代随机突变库筛选获得了催化活性较野生型提高1.5倍的突变体M010,序列分析表明其氨基酸突变为R526S。从第二代突变库中筛选出的总活力提高5.8倍突变体M020,突变位点为R526S/E88G/A200T/I519L,其比活力与M010一致,但表达量比野生型提高约4倍。对M020酶学性质表征发现,其最适pH为8.5,比野生型向碱性偏移0.5;活性中心残基酸性基团的解离常数(pK1)由野生型的7.0提高至7.5。晶体结构分析表明,突变位点R526距离活性中心较近,将其突变为Ser降低了活性中心的极性,抑制了催化残基His的解离,使酸性基团的解离常数升高。     

鉴别杰多霉素生物合成后修饰氧化酶JadH中参与底物结合或催化的关键残基

JadH是羟化脱水双功能酶,参与杰多霉素生物合成中的聚酮后修饰反应,将2,3-dehydro-UWM6催化为dehydrorabelomycin。为了分析杰多霉素生物合成途径中后修饰氧化酶JadH结合、催化底物的关键氨基酸,构建了JadH与底物复合物的三维结构模型。利用该模型并结合JadH同源蛋白氨基酸序列比对分析,推测出JadH活性中心中可能参与底物结合或催化的关键氨基酸(R50、G51、L52、G53、F100、R221、I223、P295和G298)。通过定点突变及体外酶学实验对这些位点的突变体的催化活性进行评价,结果显示这些突变株活性均显著低于野生型,表明这9个氨基酸是JadH参与底物结合或催化的关键氨基酸。     

嗜热淀粉芽孢杆菌来源β-葡萄糖苷酶的重组表达与酶学性质

【背景】β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21,β-glucosidase),是纤维素分解酶系中的重要组成部分,目前工业上应用的β-葡萄糖苷酶多数来源于植物和真菌,来源于细菌的较少,且应用中还存在酶活力偏低、热稳定性差、反应条件适用范围窄、酶活力易受产物反馈抑制等问题,增加了经济成本。嗜热微生物具有特殊的遗传信息资源,极有可能从中挖掘到酶学性质优良的新型β-葡萄糖苷酶,从而解决工业难题。【目的】从嗜热淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)基因组中挖掘新型β-葡萄糖苷酶基因,通过基因重组、异源表达和蛋白纯化技术制备新型β-葡萄糖苷酶,并探究其酶学性质,为新型β-葡萄糖苷酶在纤维素水解等领域的应用奠定基础。【方法】人工合成新型β-葡萄糖苷酶基因bgl52,构建重组表达质粒pET22b-bgl52,并用电脉冲法转化到大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化得到高纯度的β-葡萄糖苷酶Bgl52。【结果】实现重组表达质粒pET22b-bgl52在大肠杆菌BL21(DE3)中的可溶性表达,并获得β-葡萄糖苷酶Bgl52纯蛋白,蛋白分子量为52 kD,在70°C和pH 6.5条件下表现出最佳活性;以p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (p NPG)为底物时的比酶活为223.7±5.3 U/mg;K_m为9.3±1.2 mmol/L,V_(max)为270.3±4.3μmol/(min·mg);Bgl52偏好性水解β-1,4糖苷键的底物;Fe~(2+)和Mg~(2+)对酶的激活作用明显,Co~(2+)、Cu~(2+)和SDS可抑制其活性;Bgl52是少有的几种葡萄糖和木糖激活型β-葡萄糖苷酶之一,当反应体系中外源添加0.2 mol/L葡萄糖时可提升活力至2.84倍,外源添加0.4 mol/L木糖时可提升活力至3.24倍,同时Bgl52在生理条件下基本不受产物的反馈抑制。【结论】利用嗜热微生物基因组中蕴藏的遗传信息资源,通过现代生物技术方法,可以从中挖掘到酶学性质优良的β-葡萄糖苷酶,为其在纤维素降解等工业领域的应用奠定基础。     

重组根瘤农杆菌葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶性质

目前已发现的葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶均来源于真菌, 尚无原核细胞来源的相关报道。从根瘤农杆菌LBA4404中克隆β-葡萄糖苷酶基因bg1, 将其构建在表达载体pET-28b上, 转化Escherichia coli RP (DE3), IPTG诱导表达。重组β-葡萄糖苷酶的比活高达36.7 μmol/(min·mg)。对经过Ni柱纯化的重组酶进行酶学分析发现: 该酶是糖基水解酶家族1的成员, 底物亲和力高, 专一性低, 在温度为40°C和pH在5-8之间时具有较高的酶活, 在低于40°C和pH 5-10之间时可稳定保存。以pNP-β-Glc为底物, 该酶的最适pH为6.4, 最适温度为60°C, 在37°C和pH 6.4的反应体系中, 该酶的Km为0.09 mmol/L, 竞争性抑制剂葡萄糖酸-δ-内酯和葡萄糖的Ki分别为0.03 mmol/L和75 mmol/L, 具有很高的葡萄糖耐受性, 当金属离子Ag+和Zn2+存在时, 酶活被明显抑制。该酶对pNP-β-Gal和pNP-α-Glc的Km分别为3.61 mmol/L和14.31 mmol/L。     

β-葡萄糖苷酶Bgl747的定向筛选、重组表达与酶学性质

【背景】β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,EC3.2.1.21)是3种纤维素酶中的重要成分之一。目前工业用纤维素酶大都来源于木霉等真菌,较少来源于细菌,而且在应用中还存在反应条件(温度、pH等)适用范围窄、酶活力较低、获取成本偏高等问题,这大大限制了β-葡萄糖苷酶的应用。从秸秆还田土壤细菌中筛选β-葡萄糖苷酶有极大地可能性筛选出酶学性质较好的酶,从而解决现存的工业问题。【目的】从土壤中筛选β-葡萄糖苷酶,通过基因重组、表达优化和蛋白纯化获得一株新型β-葡萄糖苷酶,探究其酶学性质,为其在工业上的应用奠定基础。【方法】利用功能筛选法从土壤中筛选出β-葡萄糖苷酶,全长为747 bp,命名为Bgl747,构建重组表达质粒pET-28a-Bgl747,以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌株,经IPTG诱导实现可溶性表达并优化表达条件,通过His标签蛋白纯化试剂盒纯化获得纯化酶,探究其酶学性质。【结果】β-葡萄糖苷酶Bgl747属于BglB超家族,分子量为27.23 kD,最适反应温度为45°C,最适p H 4.0;最佳诱导条件:当OD600为1.0,加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG,于37°C、220 r/min诱导10 h后β-葡萄糖苷酶Bgl747蛋白获得最高表达量1.82 mg/m L;底物为对硝基苯-β-D-半乳糖苷(p-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside,p NPG)时的比酶活225.07 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率Vmax分别为0.268mmol/L、547.23μmol/(L·min);1mmol/LK+、1 mmol/L和10 mmol/L Fe2+、30%甲醇、30%乙醇、1 mmol/L和10 mmol/L盐酸胍对酶活都有促进作用,30%TritonX-100及10 mmol/L SDS抑制其酶活效果较为明显;该酶受到产物葡萄糖的反馈抑制,葡萄糖浓度越高,抑制效果越明显,但当葡萄糖浓度为1 mol/L时,酶活仍保持50%以上。【结论】Bgl747反应温度范围较广且稳定,酶学性质优异,为其在纤维素降解等工业应用奠定基础。     

7-木糖紫杉烷糖基水解酶LXYL-P1-1和LXYL-P1-2活性中心预测及初步的功能分析

7-木糖紫杉烷糖基水解酶LXYL-P1-1和LXYL-P1-2是克隆自真菌香菇的两个双功能酶(序列一致性97%),具有β-木糖苷酶/β-葡萄糖苷酶双重活性,能特异性地水解移除7-木糖-10-去乙酰紫杉醇等紫杉烷上的木糖基。采用生物信息学方法对两个酶蛋白进行酶活性中心预测,初步确定Asp300和Glu529分别为亲核试剂和一般酸/碱催化剂,而Asn172-Gly173-Arg174和Lys207-His208为底物结合结构域。以LXYL-P1-2为研究对象,以毕赤酵母细胞为表达宿主,应用定点突变技术获得了N172A、G173A、R174A、K207A、H208A、D300N和E529Q突变体,并进行了酶活性分析。结果显示:在分别以PNP-Xyl、PNP-Glc和7-木糖-10-去乙酰紫杉醇为底物时,N172A、G173A、R174A、K207A、D300N和E529Q的β-木糖苷酶与β-葡萄糖苷酶活性大幅度下降甚至完全消失;H208A的β-木糖苷酶活性也显著下降,但仍保持98%的β-葡萄糖苷酶活性。其结果初步验证了对上述两个酶蛋白的活性中心的预测,为进一步揭示7-木糖紫杉烷糖基水解酶结构与功能的关系提供了实验依据。     

产碱杆菌Alcaligenes sp.KS-85来源肌酸酶活性中心的关键氨基酸功能研究

肌酸酶(Creatinase,EC 3.5.3.3)水解肌酸生成尿素和肌氨酸,是肌酐多酶级联检测中的关键酶。为进一步解析产碱杆菌来源肌酸酶的催化机理,利用蛋白质同源建模、分子对接、丙氨酸扫描技术分析了酶与底物的相互作用,并聚焦于酶活性中心4个功能未知的保守位点Phe64、Asp102、Phe252、Phe321,通过将氨基酸残基定点突变为6种具有代表性的氨基酸,结合生化实验对其功能进行解析。经研究,所有突变体的kcat值大幅度降低;除6个突变体:F252A、F252S、F252Y、F252W、F321A、F321Y的KM值降低,其余突变体的KM均提高。结构分析表明Phe252通过与Tyr259形成的π-π堆积稳定酶-底物复合体;Asp102通过与Arg66,Gly322的氢键相互作用稳定酶反应的过渡态;Phe321,Phe64位于底物两侧,通过疏水侧链的排斥作用及空间位阻影响底物的定位。本研究通过对活性中心氨基酸残基的功能解析,为肌酸酶的催化机制解析和分子改造奠定了基础。     

应用易错PCR技术提高环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达

【目的】对嗜热脂肪芽孢杆菌CHB1的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)基因进行定向进化,筛选得到胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变酶。【方法】采用易错PCR技术向环糊精葡萄糖基转移酶基因中随机引入突变,建立酶基因突变文库,筛选获得胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变体,并对突变酶进行诱导表达、纯化及部分酶学性质研究。【结果】通过筛选获得CGTase胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变菌株ds-6和ep-9,其胞外α-环化活力分别是原始酶的1.72倍和2.18倍,可溶性表达量提高了1倍。序列分析表明,突变体ep-9有3个碱基发生了变化:G2005A/A2037G/T2081G,其中有2个碱基突变导致了氨基酸的改变。SWISS-MODEL数据库模拟CGTase的结构表明,2个突变氨基酸分别位于无规卷曲和β-转角/折叠之间的转角中。酶学性质测定表明:突变CGTase的β-环化比活力是原始酶的2.44倍,总环化比活力提高了34%,K_m值由4.3 g/L降低到3.74 g/L;在pH稳定性方面较原始酶有所提高。单碱基定点突变证实突变体ep-9可溶性表达水平及胞外酶活性提高的关键突变是G2005A。【结论】本试验表明:基于易错PCR技术获得嗜热芽孢杆菌CHB1的CGTase的胞外酶活和可溶性表达定向进化,G2005A突变对于提高CGTase的可溶性表达及胞外酶活起关键作用,这对认识CGTase的构效关系以及进一步改造该酶分子、扩大酶的生产应用具有重要意义。     

D-葡萄糖苷酶抑制剂的研究

用高灵敏度的荧光法研究了13种糖类化合物对α或β-D-葡萄糖苷酶的抑制作用．实验结果表明：5-氨基-5-脱氧-D-吡喃葡萄糖-1-磺酸铵盐（1）、5-氨基-5-脱氧-D-吡喃葡萄糖-1-磺酸（2）、5-氨基-5-脱氧-D-葡萄糖-1．亚硫酸加成物（3）等三种氮杂糖对α或β-D-葡萄糖苷酶均呈现竞争性抑制作用．化合物（1）的Kiα＝372μmol／L;Kiβ＝6．38μmol/L．化合物（2）的Kiα＝34．4μmol／L;Kiβ＝6．84μmol／L．化合物（3）的Kiα＝47．2μmol/L;Kiβ＝11．9μmol/L．上述三个化合物对β-D-葡萄糖苷酶的抑制作用都强子α-D-葡萄糖苷酶．尤其对化合物（1）,其Kiα／Kiβ＝58．3,表明其抑制糖苷酶活性有较好的选择性．     

GH42家族保守氨基酸位点累积突变对Geobacillus stearothermophilus来源β-半乳糖苷酶BgaB催化活性的影响

【背景】β-半乳糖苷酶转糖苷活性弱,产物低聚半乳糖(galactooligosaccharides, GOS)易被水解,致其催化得率普遍较低。【目的】以GH42家族Geobacillus stearothermophilus来源β-半乳糖苷酶BgaB为对象,探讨家族保守氨基酸位点突变对β-半乳糖苷酶BgaB催化活性的影响。【方法】在单点突变体功能研究基础上,采用定点突变与化学修饰相结合的方法,对保守氨基酸位点E303与F341进行累积突变。【结果】与野生型酶相比,所构建双点突变体Ox-E303C/F341S水解活性降低为30%;GOS最大得率由0.75%提高到19.50%。【结论】家族保守氨基酸位点累积突变能够使单点突变体功能得到共同进化,降低β-半乳糖苷酶水解活性和底物抑制作用,能够提高其转糖苷催化活性。     

通过体外分子进化技术提高淀粉液化芽胞杆菌BS5582 β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性

应用基于易错PCR随机突变的体外分子进化技术,来提高淀粉液化芽胞杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的热稳定性。利用建立的基于96微孔板高通量筛选模型,经过两轮定向进化与高通量筛选,共筛选得到3株热稳定性明显提高的突变体2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03。将野生型β-葡聚糖酶基因和热稳定性提高的突变基因的高效表达产物经镍亲和层析柱纯化后,酶学性质测定表明突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T50值分别比野生酶(53℃)提高2.2℃、5.5℃和3.5℃。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t1/2,60℃(min)分别比野生酶(18min)提高4min、13min和17min。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Vmax值为286μmol/(mg·min)、304μmol/(mg·min)和279μmol/(mg·min),分别比野生型下降8.3%、2.6%和10.6%。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Km值分别为6.76mg/mL、6.19μmg/mL和6.84mg/mL,与野生型(6.29mg/mL)基本相同。序列分析表明,3个突变体共发生7个氨基酸替代:2-JF-01(N36S,G213R)、2-JF-02(C86R,S115I,N150G)和2-JF-03(E156V,K105R)。同源建模表明,7个氨基酸替代中5个位于蛋白质表面或表面洞穴中,42.8%的替代氨基酸是精氨酸,也表明精氨酸在提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性中起重要的作用。     

嗜热革节孢GH1 BGL1进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性的影响

糖苷水解酶第一家族(GH1)β-葡萄糖苷酶(BGL1)有葡萄糖耐受性,进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性有很大影响,但具体作用机制尚不清楚。对嗜热革节孢GH1 BGL1进口端的W168、L173、F348、W349、C169、F180、D237、Y179、A260、H307、N335和E437这12个氨基酸残基进行定点突变,将突变酶与野生酶(WT)在毕赤酵母中表达,表达产物纯化后进行酶活性和葡萄糖耐受性测定。与WT相比,所有突变酶活性均有所降低,其中W168H、N335F和W349G几乎丧失活性。突变F180H、D237S、A260N和H307Y的Km低于WT,所有突变的kcat都降低。除L173Q外,其余突变都保持葡萄糖耐受性,在高浓度(400 mmol/L)葡萄糖时,Y179F和D237S酶活受到显著抑制。本研究表明,进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性均具有一定影响,催化活性通道的结构特异性可能是葡萄糖耐受机制。     

差异柠檬酸杆菌GXW-1 β-葡萄糖苷酶的酶学性质及分子改造

【目的】筛选鉴定1株产β-葡萄糖苷酶的菌株,克隆、表达该菌株中的β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行分子改造。【方法】在自然界中采集土样,筛选到1株具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株,对野生菌进行16S rDNA鉴定,比对分析Gen Bank数据库中与野生菌同属的β-葡萄糖苷酶基因序列,设计简并引物PCR扩增基因保守区;设计引物扩增目的基因,以pQE30为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中进行诱导表达;采用镍亲和层析对重组酶进行纯化,研究其酶学性质;采用易错PCR和定点随机突变相结合的方法对野生型β-葡萄糖苷酶进行分子改造。【结果】一个来自于差异柠檬酸杆菌GXW-1的β-葡萄糖苷酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶CBGL的最适温度为45°C,最适p H为6.0,V_(max)值是(0.1704±0.0073)μmol/(mg·min),K_(cat)值为(0.2380±0.0102)/s。CBGL能水解α-pNPG、甜菊苷、黄豆苷和染料木苷。对野生酶进行分子改造,获得V_(max)是野生酶2.54倍的突变体W147F。【结论】CBGL不仅具有β-1,4-糖苷键水解能力,还可能具有一定的α-糖苷键水解酶活性。此外,CBGL还能够水解天然底物甜菊苷、黄豆苷和染料木苷。这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。     

嗜酸古菌Cuniculiplasma divulgatum来源的GH1家族中温β-葡萄糖苷酶CdBglA的原核表达及酶学性质分析

葡萄糖苷酶在食品、医药、生物质转化等领域具有重要的应用价值,因此发掘适应性强、性质优良的β-葡萄糖苷酶是国内外研究的热点。本文对尚未报道的来源于嗜酸古菌(Cuniculiplasmadivulgatum)GH1家族的葡萄糖苷酶进行了克隆表达和酶学性质测定,以期找到更优的β-葡萄糖苷酶。从NCBI数据库中获取了C. divulgatum来源的GH1葡萄糖苷酶氨基酸序列,然后制备重组质粒pET-30a(+)-CdBglA,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白,对纯化后的CdBglA进行酶学性质研究。结果发现,重组酶CdBglA的分子量为56.0 kDa,最适pH为5.5,最适温度为55℃。该酶具有良好的pH稳定性,在pH 5.5-11.0范围内处理1 h,仍维持92.33%以上的酶活力。以p NPG为底物时的酶促反应动力学参数Km、Vmax和Kcat/Km分别为0.81 mmol、291.99μmol/(mg·min)和387.50s-1mmol-1。其在终浓度5mmol/L重金属离子的影响下均能保持90.33%以上的酶活力;在15%的乙醇溶液中酶活力被提高了28.67%,在2...     

链霉菌GXT6 β-葡萄糖苷酶的酶学性质及葡萄糖耐受性分子改造

【目的】从经过全基因组测序的链霉菌GXT6中克隆、表达一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行相关葡萄糖耐受性的氨基酸残基的分子改造,提高其对葡萄糖的耐受性。【方法】根据链霉菌GXT6的全基因测序结果,对其中一个注释为糖基水解酶的基因设计引物,PCR扩增目的基因,以p SE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达;采用镍亲和层析技术纯化重组蛋白质,对目的蛋白质进行酶学性质研究;采用定点饱和突变的方法对重组酶进行相关氨基酸残基的分子改造。【结果】从链霉菌GXT6中克隆到一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶的最适温度为40°C,最适p H为6.0,Km值为(0.4712±0.0180) mmol/L,Vmax值为(128.000±1.741)μmol/(min·mg),葡萄糖抑制常数Ki值为(1.8880±0.1307)mmol/L。该BGL3-GXT6能够水解黄豆苷、染料木苷、甜茶苷、虎杖苷、淫羊藿苷。还对BGL3-GXT6中与葡萄糖耐受性可能相关的氨基酸残基位点81-Trp和233-Trp进行了定点饱和突变,获得了25个具有酶活的突变酶并对其进行酶学性质研究。其中W233位点饱和突变后获得的突变酶的Km和葡萄糖抑制常数Ki值与重组酶BGL3-GXT6相比均发生明显变化,葡萄糖耐受性有不同程度的提高,最高的提高了209倍。【结论】本研究获得的BGL3-GXT6对天然底物甜茶苷、黄豆苷、染料木苷、虎杖苷和淫羊藿苷具有水解功能,这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。     

重组β-葡萄糖苷酶生产龙胆低聚糖的工艺条件优化

摘要：【目的】β-葡萄糖苷酶可用于酶法生产龙胆低聚糖。为了给龙胆低聚糖的生产提供大 量的酶来源,构建基因工程菌表达黑曲霉(CMI CC 324626)β-葡萄糖苷酶基因（bgl）并研究重组酶生产龙胆低聚糖的工艺条件。【方法】将bgl克隆到表达载体pPIC9K,转化毕赤酵母（Pichia pastoris）KM71。表达产物通过HPLC和LC-MS鉴定了其可用于生产龙胆低聚糖的转苷活性,并对酶转化葡萄糖生产龙胆低聚糖的反应条件进行了优化。【结果】实现了β-葡萄糖苷酶的过量表达。当底物葡萄糖浓度为80%,反应pH4.5,温度为60℃,加酶量为每克葡萄糖60 U,添加1 mmol/L的K+,转化周期为48 h,龙胆低聚糖累计达到最大为50 g/L。【结论】本研究是国内外首次利用重组酶酶法生产龙胆低聚糖的报道。