乳糖酶研究进展

乳糖酶作为乳品添加剂,应用相当广泛,通过来源及其性质、基础研究和应用等方面对乳糖酶进行综述,重点介绍乳糖酶研究上的新进展和应用的新领域,由于近年来低温乳糖酶成为研究热点,特别对低温乳糖酶的研究进行介绍.     

β-葡萄糖苷酶Bgl2238生物信息学分析

利用生物信息学方法对β-葡萄糖苷酶Bgl2238的氨基酸序列进行分析。采用Prot Param、DNAMAN、Multicoil、SOPMA、PROSAN等软件对其理化性质、亲/疏水性、不稳定指数、PEST序列、蛋白质二级结构及蛋白质修饰位点等重要参数进行预测,并对其三级结构进行同源建模及模建结果质量的评估。结果发现:Bgl2238由745个氨基酸组成,蛋白质序列中α-螺旋占36.64%,β-延伸链占19.06%,β-转角占9.40%,无规则卷曲占34.90%,存在14段非PEST序列,具有41个不同蛋白质修饰位点。采用在线网站SWISS-MODEL建模得到了Bgl2238的三级结构,分析蛋白质可及性并分析得到Ramachandran图,检测结果说明三维结构是合理的。本研究结果为β-葡萄糖苷酶Bgl2238进一步研究水解功能及提高其酶活性奠定了理论基础。     

β-葡萄糖苷酶Bgl747的定向筛选、重组表达与酶学性质

【背景】β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,EC3.2.1.21)是3种纤维素酶中的重要成分之一。目前工业用纤维素酶大都来源于木霉等真菌,较少来源于细菌,而且在应用中还存在反应条件(温度、pH等)适用范围窄、酶活力较低、获取成本偏高等问题,这大大限制了β-葡萄糖苷酶的应用。从秸秆还田土壤细菌中筛选β-葡萄糖苷酶有极大地可能性筛选出酶学性质较好的酶,从而解决现存的工业问题。【目的】从土壤中筛选β-葡萄糖苷酶,通过基因重组、表达优化和蛋白纯化获得一株新型β-葡萄糖苷酶,探究其酶学性质,为其在工业上的应用奠定基础。【方法】利用功能筛选法从土壤中筛选出β-葡萄糖苷酶,全长为747 bp,命名为Bgl747,构建重组表达质粒pET-28a-Bgl747,以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌株,经IPTG诱导实现可溶性表达并优化表达条件,通过His标签蛋白纯化试剂盒纯化获得纯化酶,探究其酶学性质。【结果】β-葡萄糖苷酶Bgl747属于BglB超家族,分子量为27.23 kD,最适反应温度为45°C,最适p H 4.0;最佳诱导条件:当OD600为1.0,加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG,于37°C、220 r/min诱导10 h后β-葡萄糖苷酶Bgl747蛋白获得最高表达量1.82 mg/m L;底物为对硝基苯-β-D-半乳糖苷(p-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside,p NPG)时的比酶活225.07 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率Vmax分别为0.268mmol/L、547.23μmol/(L·min);1mmol/LK+、1 mmol/L和10 mmol/L Fe2+、30%甲醇、30%乙醇、1 mmol/L和10 mmol/L盐酸胍对酶活都有促进作用,30%TritonX-100及10 mmol/L SDS抑制其酶活效果较为明显;该酶受到产物葡萄糖的反馈抑制,葡萄糖浓度越高,抑制效果越明显,但当葡萄糖浓度为1 mol/L时,酶活仍保持50%以上。【结论】Bgl747反应温度范围较广且稳定,酶学性质优异,为其在纤维素降解等工业应用奠定基础。     

源于红树林土壤宏基因组文库的新型磷脂酶A1基因的筛选、克隆表达及酶学性质

【目的】利用宏基因组学的方法从红树林土壤中筛选新型酯水解酶类。【方法】构建红树林土壤宏基因组文库,采用以三丁酸甘油酯为底物的功能筛选方法,对筛选出的阳性克隆进行系统发育树分析,实现新型磷脂酶A1基因的原核表达,研究重组酶的酶学性质。【结果】筛选到一个新的磷脂酶A1编码基因phop1413 (GenBank登录号KF767097),测序表明其全长1 413 bp,可编码470个氨基酸残基,表达蛋白约51.7 kD,表达量高达220 mg/L,NCBI中Blast比对及系统进化树分析显示该蛋白属于磷脂酶类的fAMILY Ⅵ家族;酶学性质分析表明,该重组酶的最适反应底物为对硝基苯酚己酸酯,比酶活为124 U/mg;最适反应温度为54 °C,最适pH 7.8;50 °C热处理1.5 h剩余相对酶活为44%,表现出很好的热稳定性。【结论】通过构建宏基因组文库利用功能筛选方法获得一个新型磷脂酶A1基因;研究中获得的新型磷脂酶A1性质较好,可用于植物油酶法脱胶。     

热稳定α-半乳糖苷酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

克隆前期筛得分枝犁头霉Absidia ramosa WL511的热稳定α-半乳糖苷酶cDNA基因aga(GenBank No.DQ234280),将aga基因插入表达载体pPICZαA并电转化整合到毕赤酵母P.pastoris GS115的染色体上。30℃、甲醇流加量0.5%(V/V)时,酵母发酵上清液中酶活达32U/ml。纯化后酶的比活力为137U/mg,SDS-PAGE显示单一条带,凝胶过滤和SDS-PAGE估算其分子量分别为348kDa和87kDa,该酶为四聚体结构,糖基化导致重组蛋白的分子量比原酶大6kDa。该酶等电点为5.2,最适反应温度73℃,最适pH6.8,60℃以下及pH5.5～9.0范围内活性稳定。75℃时保温2小时保留54%的酶活,85℃时酶活完全消失。以对硝基苯酚-α-D-半乳糖苷为底物,该酶Km值为0.42mmol/Lol/L;Vmax为413U/mg;kcat为64531/min。     

漆酶Lac1338的酶学特性测定及定向突变对其酶解染料影响北大核心CSCD

为了获得表达量高、热稳定性好的漆酶,通过密码子优化合成漆酶基因lac1338、连接到pET-32a(+)载体上并在Escherichia coli BL21(DE3)中表达,获得HIS-Lac1338蛋白。酶学性质测定结果显示,以ABTS为底物时,HIS-Lac1338的比活力高达22.8 U/mg,Km和Vmax分别为567μmol/L和2.8 mmol/(L·min·g);HIS-Lac1338的最适反应温度为55℃,最适pH为6.0;在55℃以下保温2 h能保留50%的酶活性,在pH 4-8范围内孵育4 h仍保留50%以上的活性;HIS-Lac1338对Cu^(2+)抗性强,Ca^(2+)、Na^+、K^+对HIS-Lac1338有促进作用,而Co^(2+)、Fe^(2+)、Hg^(2+)、Ag^+等重金属离子对HIS-Lac1338有抑制作用。易错PCR方法得到的Lac1338的突变酶Lac16与HIS-Lac1338相比,对酸性紫7、溴酚蓝、考马斯亮蓝的降解率分别由10.9%、20%和25%提高到90.5%、67.8%和85%。结果表明,HIS-Lac1338具有较好的温度及pH稳定性,而通过易错PCR技术定向突变获得的突变酶Lac16的染料降解率大大提高。     

丁醇对发酵生产3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯(PHBHHx)单体组成的影响

3羟基丁酸与3羟基己酸共聚酯(PHBHHx)是由微生物合成的完全可降解高分子材料,其材料性能与3羟基己酸(3HHx)在共聚物中的含量有关。嗜水性气单孢菌A.hydrophila4AK4合成的PHBHHx中,3HHx含量通常都在12～15mol%之间。通过在培养基中添加正丁醇,降低了PHBHHx中3HHx的含量。在摇瓶培养中获得了含3HHx为58mol%的PHBHHx;在6L发酵罐中54h的发酵培养,获得40gL的细胞干重(CDW),并将3HHx的含量在发酵过程中有效地降低到5～10mol%。     

重组大肠杆菌Bgl2238的发酵优化

本研究对前期实验室从黑龙江玉米土壤中筛选并构建的β-葡萄糖苷酶Bgl2238的重组大肠杆菌(E.coliBL21(DE3)-pET32a-bgl2238)采用响应面(Box-Behnken)优化的方法进行摇瓶发酵,优化培养基组分,而培养条件即温度、pH值、接种量及装液量则采用单因素法优化。结果显示最佳培养基配比为:甘油9.32g/L、酵母提取粉12g/L、胰蛋白胨19.13g/L、NaCl8g/L、K_2HPO_4·3H_2O 19.13g/L、KH_2PO_42g/L、柠檬酸高铁胺0.2g/L和微量元素母液6mL/L。重组大肠杆菌Bgl2238最佳的发酵条件为:发酵温度37℃、起始pH8.0、3%接种量、25mL装液量、IPTG终浓度为0.25mmol/L。在250mL锥形瓶对重组子Bgl2238进行发酵,在最优化的发酵培养基成分和培养条件下,Bgl2238的酶活力可以达到2910U/L,比起始培养基中的酶活提高了61.77%。