通过体外分子进化技术提高淀粉液化芽胞杆菌BS5582 β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性

应用基于易错PCR随机突变的体外分子进化技术,来提高淀粉液化芽胞杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的热稳定性。利用建立的基于96微孔板高通量筛选模型,经过两轮定向进化与高通量筛选,共筛选得到3株热稳定性明显提高的突变体2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03。将野生型β-葡聚糖酶基因和热稳定性提高的突变基因的高效表达产物经镍亲和层析柱纯化后,酶学性质测定表明突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T50值分别比野生酶(53℃)提高2.2℃、5.5℃和3.5℃。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t1/2,60℃(min)分别比野生酶(18min)提高4min、13min和17min。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Vmax值为286μmol/(mg·min)、304μmol/(mg·min)和279μmol/(mg·min),分别比野生型下降8.3%、2.6%和10.6%。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Km值分别为6.76mg/mL、6.19μmg/mL和6.84mg/mL,与野生型(6.29mg/mL)基本相同。序列分析表明,3个突变体共发生7个氨基酸替代:2-JF-01(N36S,G213R)、2-JF-02(C86R,S115I,N150G)和2-JF-03(E156V,K105R)。同源建模表明,7个氨基酸替代中5个位于蛋白质表面或表面洞穴中,42.8%的替代氨基酸是精氨酸,也表明精氨酸在提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性中起重要的作用。