芽胞杆菌菌体蛋白提取方法的比较

目的：比较不同破碎方法下3种芽胞杆菌菌体蛋白的提取效果。方法：以菊酯类农药降解菌巨大芽胞杆菌、球形芽胞杆菌、弯曲芽胞杆菌为研究对象,以裂解液为提取介质,分别采用超声波破碎法、水煮法和机械破碎法提取芽胞杆菌蛋白,并通过革兰染色电镜观察菌株破碎程度,用SDS-PAGE和Bradford法测定蛋白浓度。结果：革兰染色电镜观察发现玻璃珠机械破碎法对3种芽孢杆菌的细胞壁破碎程度最明显,其次为超声波破碎法,水煮法破碎效果不明显。SDS-PAGE和Bradford法测定结果表明,巨大芽胞杆菌、球形芽胞杆菌、弯曲芽胞杆菌经玻璃珠机械破碎后,提取的蛋白图谱条带清晰,丰度高,重复性好,含量分别为20.247、19.902和18.893 mg/mL;经超声波破碎提取的蛋白图谱条带较清晰,丰度一般,重复性不好,含量分别为10.572、9.438和10.424 mg/mL;经沸水浴破碎提取的蛋白图谱条带模糊,丰度低,重复性差,含量分别为1.366、1.119和1.136 mg/mL。结论：玻璃珠机械破碎法是破碎3种芽胞杆菌的最优方法,破碎后提取的蛋白含量高,条带清晰,重复性好。     

应用易错PCR技术提高环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达

【目的】对嗜热脂肪芽孢杆菌CHB1的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)基因进行定向进化,筛选得到胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变酶。【方法】采用易错PCR技术向环糊精葡萄糖基转移酶基因中随机引入突变,建立酶基因突变文库,筛选获得胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变体,并对突变酶进行诱导表达、纯化及部分酶学性质研究。【结果】通过筛选获得CGTase胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变菌株ds-6和ep-9,其胞外α-环化活力分别是原始酶的1.72倍和2.18倍,可溶性表达量提高了1倍。序列分析表明,突变体ep-9有3个碱基发生了变化:G2005A/A2037G/T2081G,其中有2个碱基突变导致了氨基酸的改变。SWISS-MODEL数据库模拟CGTase的结构表明,2个突变氨基酸分别位于无规卷曲和β-转角/折叠之间的转角中。酶学性质测定表明:突变CGTase的β-环化比活力是原始酶的2.44倍,总环化比活力提高了34%,K_m值由4.3 g/L降低到3.74 g/L;在pH稳定性方面较原始酶有所提高。单碱基定点突变证实突变体ep-9可溶性表达水平及胞外酶活性提高的关键突变是G2005A。【结论】本试验表明:基于易错PCR技术获得嗜热芽孢杆菌CHB1的CGTase的胞外酶活和可溶性表达定向进化,G2005A突变对于提高CGTase的可溶性表达及胞外酶活起关键作用,这对认识CGTase的构效关系以及进一步改造该酶分子、扩大酶的生产应用具有重要意义。     

分子伴侣共表达对嗜热环糊精葡萄糖基转移酶异源可溶性表达的影响

【目的】通过优化表达条件,提高嗜热环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的可溶性表达和胞外酶活性。【方法】构建含cgt基因的重组表达质粒p ET-28a(+)-omp A-cgt,筛选最适诱导温度,并构建5种分子伴侣共表达系统(p KJE8、p KJE7、p Gro7、p Tf16和p G-Tf2,5种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒p ET-28a(+)-omp A-cgt共表达),筛选最适分子伴侣质粒,优化共表达条件。【结果】通过SDS-PAGE分析和测定胞外酶活,CGTase基因在大肠杆菌中实现表达,且具有一定量的重组CGTase分泌至胞外;25°C诱导时CGTase的可溶性表达和在胞外上清中的酶活都最高;分子伴侣质粒p KJE8使酶的胞外活性提高了48.6%,效果最为显著;当L-阿拉伯糖浓度为0.5 g/L时,分子伴侣质粒p KJE8使酶的胞外活性提高了68.5%。【结论】通过优化表达条件及使用分子伴侣共表达系统提高了环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达和胞外酶活,为该酶进一步相关研究奠定了基础。