| 应用易错PCR技术提高环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达 |
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| 引用本文： | 郭永华,陈济琛,贾宪波,陈龙军,蔡海松,林新坚.应用易错PCR技术提高环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达[J].微生物学报,2016,56(10):1551-1560. |
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| 作者姓名： | 郭永华 陈济琛 贾宪波 陈龙军 蔡海松 林新坚 |
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| 作者单位： | 福建省农业科学院土壤肥料研究所, 福建 福州 350003;福建农林大学生命科学学院, 福建 福州 350002,福建省农业科学院土壤肥料研究所, 福建 福州 350003,福建省农业科学院土壤肥料研究所, 福建 福州 350003;福建农林大学生命科学学院, 福建 福州 350002,福建省农业科学院土壤肥料研究所, 福建 福州 350003,福建省农业科学院土壤肥料研究所, 福建 福州 350003,福建省农业科学院土壤肥料研究所, 福建 福州 350003;福建农林大学生命科学学院, 福建 福州 350002 |
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| 基金项目： | 国家公益性农业科研专项（201303094-05）；福建省自然科学基金项目（2014J01105）；福建省属公益类科研院所基本科研专项（2014R1022-3）；福建财政社会公益研究（2060302） |
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| 摘 要： | 【目的】对嗜热脂肪芽孢杆菌CHB1的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)基因进行定向进化,筛选得到胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变酶。【方法】采用易错PCR技术向环糊精葡萄糖基转移酶基因中随机引入突变,建立酶基因突变文库,筛选获得胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变体,并对突变酶进行诱导表达、纯化及部分酶学性质研究。【结果】通过筛选获得CGTase胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变菌株ds-6和ep-9,其胞外α-环化活力分别是原始酶的1.72倍和2.18倍,可溶性表达量提高了1倍。序列分析表明,突变体ep-9有3个碱基发生了变化:G2005A/A2037G/T2081G,其中有2个碱基突变导致了氨基酸的改变。SWISS-MODEL数据库模拟CGTase的结构表明,2个突变氨基酸分别位于无规卷曲和β-转角/折叠之间的转角中。酶学性质测定表明:突变CGTase的β-环化比活力是原始酶的2.44倍,总环化比活力提高了34%,K_m值由4.3 g/L降低到3.74 g/L;在pH稳定性方面较原始酶有所提高。单碱基定点突变证实突变体ep-9可溶性表达水平及胞外酶活性提高的关键突变是G2005A。【结论】本试验表明:基于易错PCR技术获得嗜热芽孢杆菌CHB1的CGTase的胞外酶活和可溶性表达定向进化,G2005A突变对于提高CGTase的可溶性表达及胞外酶活起关键作用,这对认识CGTase的构效关系以及进一步改造该酶分子、扩大酶的生产应用具有重要意义。
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| 关 键 词： | 嗜热环糊精葡萄糖基转移酶 可溶性表达 定向进化 易错PCR |
| 收稿时间： | 2015/12/21 0:00:00 |
| 修稿时间： | 2016/2/19 0:00:00 |
Improving soluble expression of Geobacillus sp. B1 CGTase by errorprone PCR |
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| Yonghua Guo,Jichen Chen,Xianbo Ji,Longjun Chen,Haisong Cai and Xinjian Lin.Improving soluble expression of Geobacillus sp. B1 CGTase by errorprone PCR[J].Acta Microbiologica Sinica,2016,56(10):1551-1560. |
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| Authors: | Yonghua Guo Jichen Chen Xianbo Ji Longjun Chen Haisong Cai and Xinjian Lin |
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| Institution: | Soil and Fertilizer Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, Fujian Province, China;College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China,Soil and Fertilizer Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, Fujian Province, China,Soil and Fertilizer Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, Fujian Province, China;College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China,Soil and Fertilizer Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, Fujian Province, China,Soil and Fertilizer Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, Fujian Province, China and Soil and Fertilizer Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, Fujian Province, China;College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | thermophilic cyclodextrin glucosetransferase soluble expression directed evolution errorprone PCR |
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