应用易错PCR技术提高环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达

【目的】对嗜热脂肪芽孢杆菌CHB1的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)基因进行定向进化,筛选得到胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变酶。【方法】采用易错PCR技术向环糊精葡萄糖基转移酶基因中随机引入突变,建立酶基因突变文库,筛选获得胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变体,并对突变酶进行诱导表达、纯化及部分酶学性质研究。【结果】通过筛选获得CGTase胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变菌株ds-6和ep-9,其胞外α-环化活力分别是原始酶的1.72倍和2.18倍,可溶性表达量提高了1倍。序列分析表明,突变体ep-9有3个碱基发生了变化:G2005A/A2037G/T2081G,其中有2个碱基突变导致了氨基酸的改变。SWISS-MODEL数据库模拟CGTase的结构表明,2个突变氨基酸分别位于无规卷曲和β-转角/折叠之间的转角中。酶学性质测定表明:突变CGTase的β-环化比活力是原始酶的2.44倍,总环化比活力提高了34%,K_m值由4.3 g/L降低到3.74 g/L;在pH稳定性方面较原始酶有所提高。单碱基定点突变证实突变体ep-9可溶性表达水平及胞外酶活性提高的关键突变是G2005A。【结论】本试验表明:基于易错PCR技术获得嗜热芽孢杆菌CHB1的CGTase的胞外酶活和可溶性表达定向进化,G2005A突变对于提高CGTase的可溶性表达及胞外酶活起关键作用,这对认识CGTase的构效关系以及进一步改造该酶分子、扩大酶的生产应用具有重要意义。     

阿维菌素起始酰基转移酶的底物特异性

[背景]阿维菌素起始酰基转移酶(AveAT0)能够以2-甲基丁酰-辅酶A (coenzyme A,CoA)和异丁酰-CoA作为起始单元分别合成"a"系列或"b"系列的阿维菌素。[目的]探究AveAT0对两种底物的偏好性并进行改造。[方法]通过与识别不同底物的起始酰基转移酶(loading acyltransferases,AT0s)进行序列比对,找到AveAT0底物结合重要的氨基酸,利用活性位点定点突变的方法得到对底物偏好性改变的特定突变体。以2-甲基丁酰-CoA、异丁酰-CoA的类似物2-甲基丁酰-N-乙酰半胱氨(N-acetylcysteamine,SNAC)和异丁酰-SNAC为底物,用Ellman测试法检测释放SNAC的游离巯基(sulfhydryl,SH),测定AveAT0及其突变体的动力学常数,以此表征AveAT0及其突变体的底物偏好性。[结果]AveAT0对2-甲基丁酰SNAC的Km值为0.4 mmol/L,kcat值为14.1 min^-1,kcat/Km为32.1 L/(mmol·min);对异丁酰-SNAC的Km值为0.8 mmol/L,kcat值为6.4 min^-1,kcat/Km为7.5 L/(mmol·min)。选定的突变位点为V224M、Q149L、L121M。按顺序累积突变后发现三突变株AveAT0 V224M/Q149L/L121M对两个底物的偏好性区别最大,对2-甲基丁酰SNAC的Km值为0.8 mmol/L,kcat值为5.4 min^-1,kcat/Km为6.9 L/(mmol·min);对异丁酰-SNAC的kcat/Km为0.1 L/(mmol·min)。[结论]研究发现了AveAT0识别底物过程中的关键氨基酸,为改造阿维菌素聚酮合酶酰基转移酶提供了依据。     

鞘糖脂内切糖苷酶的半理性设计

[目的]对鞘糖脂内切糖苷酶EGCaseⅡ进行半理性设计,获得高水解活性突变体。[方法]用半理性设计方法进行突变库设计,利用HPLC对突变库进行筛选,随后对阳性突变体进行动力学及底物谱表征,并利用结构建模对活性提高的分子机制进行解析。[结果]获得了对鞘糖脂GM1、GM3水解活性提高的突变体S63G/D311E、I276L/D311V,活性分别提高为野生型的25.3倍、11.8倍。酶动力学表征显示,S63G/D311E的K_M由0.17 mmol/L降低到0.06 mmol/L,kcat由5.5 min~(-1)增大到50.3 min~(-1)。酶-底物复合物模式结构分析表明,D311E、D311V、I276L这几种突变更有利于酶与底物结合,从而提高酶活性。[结论]通过半理性设计成功获得对GM1和GM3水解活性分别提高25.3倍和11.8倍的EGCaseⅡ突变体。     

定点突变提高环氧化物水解酶AuEH2催化对甲基苯基缩水甘油醚的对映选择性*

环氧化物水解酶可催化外消旋环氧化物的动力学拆分或对映归一性水解制备手性环氧化物或邻二醇,具有广阔的应用前景.为提高宇佐美曲霉环氧化物水解酶 (AuEH2) 催化外消旋对甲基苯基缩水甘油醚 (rac-pMPGE) 的对映体选择率 (E).通过分子动力学模拟 (MD) 选取相互作用频率最高的位点A250替换为其他19种氨基酸;选取对映选择性显著提高的突变体测定其动力学参数 (K_m和k_cat) 及区域选择性系数 (β_S和β_R),并利用重组大肠杆菌全细胞拆分rac-pMPGE.突变体AuEH2^A250H的E值从12.7提高至38.4,重组菌比活力为51.9U/g湿细胞;其水解 (S)-pMPGE的k_cat/K_m从10.0mmol/(L·s)提高至12.8 mmol/(L·s),而水解 (R)-pMPGE的k_cat/K_m从1.13mmol/(L·s)降低至0.35mmol/(L·s);全细胞拆分20mmol/L rac-pMPGE获得 (R)-pMPGE的ee_s为>99%,产率从33.0% 提高至40.7%.A250位点的突变对AuEH2的对映选择性和酶活力具有显著影响;高对映选择性的AuEH2突变体在制备高光学纯的 (R)-pMPGE中具有应用潜力.     

拟南芥谷胱甘肽S-转移酶Zeta类进化酶的获得及其特性分析

拟南芥谷胱甘肽S-转移酶Zeta类(AtGSTZ)是一种与细胞代谢和环境净化密切相关的多功能酶.应用易错PCR和多轮DNA洗牌技术构建了AtGSTZ随机突变文库;再利用pH指示剂颜色改变法对突变文库进行筛选,获得了9个二氯乙酸脱氯活性提高的突变子.其中,NN23含25个氨基酸突变,比活力提高120%,NN20含24个氨基酸突变,比活力提高102%,EC1含2个氨基酸突变,比活力提高47%,其他6个为单点突变,比活力分别提高9%～60%.酶学分析显示,所有进化酶对底物二氯乙酸的催化效率和对谷胱甘肽的亲和力以及个别进化酶的复性能力都得到不同程度的提高,但热稳定性均没有明显改善.同时,对一系列与AtGSTZ空间折叠及催化活性相关位点进行了讨论.     

黄翅大白蚁来源β-葡萄糖苷酶的分子改造

纤维素水解成为葡萄糖需要一系列纤维素酶的作用,其中β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases)起着至关重要的作用。来自于培菌白蚁中肠的β-葡萄糖苷酶(MbmgBG1)具有较高的葡萄糖耐受性(1.5 mol/L的葡萄糖,保持60%以上的酶活力),但是,酶活力低和热稳定性差限制了β-葡萄糖苷酶(MbmgBG1)在食品以及工业领域中的应用。因此通过对保守氨基酸附近的非保守氨基酸定点突变,获得点突变体(F167L、T176C、E347I、R354K、N393G和V425M),其中突变体F167L、R354K的比活力(底物pNPG)比MbmgBG1分别高出约2倍和4倍。突变体的K_(cat)/K_m值比野生型大,反映了突变体对底物的亲和力以及催化能力比MbmgBG1强。当酶活力保留60%以上时,MbmgBG1所耐受的葡萄糖浓度为1.5 mol/L,而F167L为2.0 mol/L,R354K为3.0 mol/L。这些特性的增强表明,对活性中心附近保守区域内的非保守氨基酸突变,可以较大程度地影响活性,因此需要更深入地研究β-葡萄糖苷酶的活性中心位点,进行改造以提高催化效率。     

一个新的L-半胱亚磺酸脱羧酶基因的分析和突变

【目的】完成一个来源于碱性污染土壤宏基因组文库的新的L-半胱亚磺酸脱羧酶基因undec1A的鉴定,研究其酶学性质并利用非理性设计技术对其进行分子改造。【方法】以p ETBlue-2为表达载体构建包含undec1A基因的重组表达质粒,转化至宿主细胞E.coli Tuner(DE3)p Lac?中构建重组表达克隆,采用镍亲和层析完成了酶蛋白的分离纯化,完成其生化特征研究,利用连续易错PCR技术对Undec1A蛋白进行分子改造。【结果】生物信息学分析结果揭示Undec1A蛋白与已知的L-半胱亚磺酸脱羧酶存在类似的辅酶结合位点和底物识别催化基序等。分子对接结果显示氨基酸残基Val237、Asp239、Asp266、Ile267、Ala268和Lys298等决定了与底物分子L-半胱亚磺酸的识别和结合催化。以L-半胱亚磺酸作为底物,重组Undec1A蛋白的最适作用p H为7.0,最适作用温度为35°C;分子动力学常数K_m为(1.557±0.015)mmol/L,V_(max)为(49.07±3.19)μmol/(L·min),k_(cat)为(45.80±1.32)/min。利用连续易错PCR技术完成了亲本酶的分子改造,分离筛选到了一个酶活力更高的突变酶Undec1A-1180。在优化条件下,Undec1A-1180的比活力较亲本酶提高了约5.62倍。【结论】本研究为构建牛磺酸的生物合成工艺提供了理论参考,因而具有重要的实践意义。     

用底物类似物抗性法选育海因酶高产菌种

以底物类似物抗性作为选择性标记来筛选高产海因酶的突变菌种。假单胞菌(Pscudomonas sp. )J43通过紫外光、亚硝基胍、亚硝基胍加5-氟尿嘧啶三次诱变处理后,测定了161株有5-氟尿嘧啶抗性的突变株的产海因酶活力,得到的突变株M39产海因酶活力比出发株提高了13.7倍。此法对选育其他酶或其催化产物的高产菌种可能也有意义。     

海带磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的提取和特性(简报)

提取得到的海带PEP羧激酶粗酶比活性为1.21nmolNADH/mg蛋白·分。经硫酸铵分步沉淀和冻融过程后其比活性提高近4倍。抗氧化剂可提高PEPCK活性。该酶催化的羧化反应底物是PEP。ADP和Mn~(2+)是必需的辅助因子。酶反应的最适pH值是7.5。用部分纯化酶测得底物HCO_3~-的K_m值是14.0mmol/L,pEP是0.3mmol/L,ADP是0.1 mmol/L。     

蔗糖富集环境中蔗糖磷酸化酶的酶学性质研究与改造

【背景】蔗糖富集土壤是蔗糖磷酸化酶的重要来源之一。此酶能以较廉价的蔗糖为底物进行转葡萄糖基反应,改善受体底物的理化性质,因而具有重要的应用价值。【目的】研究蔗糖富集土壤中蔗糖磷酸化酶的酶学性质和转糖苷活性,为其更优质的改造提供材料和理论基础。【方法】将宏基因组中获得的蔗糖磷酸化酶基因克隆到表达载体上构建重组大肠杆菌,诱导表达并进行镍亲和层析纯化蛋白。以蔗糖为底物测量重组酶的基本酶学性质,研究其对糖类底物的转糖苷活性。通过底物通道分析,利用反向PCR技术对其第155位点进行饱和突变,并测定突变体基本酶学性质和转糖苷活性。【结果】纯化的酶蛋白分子量大小约为56 kD,活性状态时以三聚体形式存在。在以蔗糖为底物时,最适温度和最适pH值分别为55°C和6.5;Km和Vmax值分别为23.1±2.4 mmol/L和407.9±8.5μmol/(mg·min),对第155位点进行了定点饱和突变,获得了部分酶学性质或转糖苷活性改善的突变体。【结论】宏基因组中蔗糖磷酸化酶的研究丰富了酶学数据,并通过分子改造获得了部分性质更优的突变体,为转糖苷活性关键氨基酸的研究和该酶的工业应用奠定了基础。     

Structure-Guided Systems-Level Engineering of Oxidation-Prone Methionine Residues in Catalytic Domain of an Alkaline α-Amylase from Alkalimonas amylolytica for Significant Improvement of Both Oxidative Stability and Catalytic Efficiency

High oxidative stability and catalytic efficiency are required for the alkaline α-amylases to keep the enzymatic performance under the harsh conditions in detergent industries. In this work, we attempted to significantly improve both the oxidative stability and catalytic efficiency of an alkaline α-amylase from Alkalimonas amylolytica by engineering the five oxidation-prone methionine residues around the catalytic domain via a systematic approach. Specifically, based on the tertiary structure analysis, five methionines (Met 145, Met 214, Met 229, Met 247 and Met 317) were individually substituted with oxidation-resistant threonine, isoleucine and alaline, respectively. Among the created 15 mutants, 7 mutants M145A, M145I, M214A, M229A, M229T, M247T and M317I showed significantly enhanced oxidative stability or catalytic efficiency. In previous work, we found that the replacement of M247 with leucine could significantly improve the oxidative stability. Thus, these 8 positive mutants (M145A, M145I, M214A, M229A, M229T, M247T, M247L and M317I) were used to conduct the second round of combinational mutations. Among the constructed 85 mutants (25 two-point mutants, 36 three-point mutants, 16 four-point mutants and 8 five-point mutants), the mutant M145I-214A-229T-247T-317I showed a 5.4-fold increase in oxidative stability and a 3.0-fold increase in catalytic efficiency. Interestingly, the specific activity, alkaline stability and thermal stability of this mutant were also increased. The increase of salt bridge and hydrogen bonds around the catalytic domain contributed to the significantly improved catalytic efficiency and stability, as revealed by the three-dimensional structure model of wild-type alkaline α-amylase and its mutant M145I-214A-229T-247T-317I. With the significantly improved oxidative stability and catalytic efficiency, the mutant M145I-214A-229T-247T-317I has a great potential as a detergent additive, and this structure-guided systems engineering strategy may be useful for the protein engineering of the other microbial enzymes to fulfill industrial requirements.     

大肠杆菌CM/PDT抗反馈抑制突变体的构建及其性质

为了获得具有高催化活性且抗反馈抑制的大肠杆菌分支酸变位酶 预苯酸脱水酶 (chorismatemutase prephenatedehydrataseCM PDT) [EC5 .4 .99.5 EC4 .2 .1.5 1],通过相关菌种CM PDT氨基酸序列同源比较 ,寻找高度保守位点 .用定点突变及PCR法构建突变酶M1(缺失 30 4T、30 5G、Q30 6K)、M2 (缺失W 338)、M3(缺失 30 1～ 386位氨基酸 )、M32 9(E32 9A)和M374 (C374A) ,野生型及各突变型基因与pET2 8a(+ )载体连接后 ,表达融合蛋白 .在非变性条件下 ,由TALON金属螯合亲和层析柱纯化野生型和突变体的酶蛋白 .酶活性测定表明 ,突变体M3的PDT活性下降为野生型活性的 2 9% ,但保持了CM活性 .突变体M374保持了CM ,PDT两种酶的活性 ,突变体M1、M2、M32 9的CM ,PDT活性有一定程度的提高 .酶抗反馈抑制作用检测表明 ,突变体M3、M374解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用 ,M1、M2、M32 9部分解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用 .与含野生型pheA基因的E .coliBL2 1菌株相比 ,含突变基因的E .coliBL2 1菌株对 10mmol L的苯丙氨酸代谢类似物具有强的抗反馈抑制作用 ,其中M1,M2 ,M3对 2 0mmol L的类似物具有抗反馈抑制作用     

高浓度底物下青霉素扩环酶的活性评价与底物抑制现象

本文对青霉素扩环酶(Penicillin expandase,也称Deacetoxycephalosporin C synthase,DAOCS)在高浓度青霉素G下的底物抑制现象进行初步评价与表征,筛选适合工业应用条件的高活力突变体。我们通过HPLC对已报道的几个DAOCS高活力突变体在青霉素G浓度5.6至500 mmol/L间的比活力进行定量测定,并与不同催化反应动力学模型的理论推测变化趋势比较,发现DAOCS野生型酶及高活力突变体H4、H5、H6与H7在高浓度青霉素G条件下均表现出明显的底物抑制现象,但是变化趋势不同。野生型酶与突变体H4的比活力先上升后下降,与竞争性抑制模型预测不符。突变体H5、H6与H7的比活力变化呈现更复杂的变化趋势。在所有测试的突变体中,H6的活性显著高于其他突变体酶。青霉素G对野生型DAOCS的底物抑制现象符合非竞争性抑制模型的预测。而部分突变体表现出复杂的底物抑制行为,表明其具有更复杂的作用机制。在高底物浓度下筛选具有较强催化活性的青霉素扩环酶突变体对于推动其在工业生产中的应用具有重要指导作用。     

S-2-氯丙酸脱卤酶的定向进化及其应用

为提高S-2-氯丙酸脱卤酶的活力,通过易错PCR的方法将源于假单胞菌(Pseudomonas sp.CGMCC 3267)的脱卤酶(DehII)进行定向进化,进化酶DehII-B2的比活提高3.9倍。同源模建两者的三维结构,并与底物进行分子对接。结果表明,突变位点为A7I,进化酶DehII-B2的结合能比原始酶降低了1.4kcal/mol,活性中心Asp10与底物α碳原子的距离缩短了0.321 6nm,因而加快了酶反应速率、提高了酶比活。目前,该酶的比活高于实验室已得酶。与原始酶相比,其最适温度和热稳定性略有增加,最适pH和pH稳定性没有明显变化。对该酶的应用做了初步的探索,结果表明在40℃,60mmol/L底物浓度下反应10h,转化率达到49.6%,ees>99.9%,因此该酶有一定的应用价值。     

Kinetic studies of Thermobifida fusca Cel9A active site mutant enzymes

Thermobifida fusca Cel9A-90, an unusual family 9 enzyme, is a processive endoglucanase containing a catalytic domain closely linked to a family 3c cellulose binding domain (Cel9A-68) followed by a fibronectin III-like domain and a family 2 cellulose binding domain. To study its catalytic mechanism, 12 mutant genes with changes in five conserved residues of Cel9A-68 were constructed, cloned, and expressed in Escherichia coli. The purified mutant enzymes were assayed for their activities on (carboxymethyl)cellulose, phosphoric acid-swollen cellulose, bacterial microcrystalline cellulose, and 2,4-dinitrophenyl beta-D-cellobioside. They were also tested for ligand binding, enzyme processivity, and thermostability. The results clearly show that E424 functions as the catalytic acid, D55 and D58 are both required for catalytic base activity, and Y206 plays an important role in binding, catalysis, and processivity, while Y318 plays an important role in binding of crystalline cellulose substrates and is required for processivity. Several amino acids located in a loop at the end of the catalytic cleft (T245-L251) were deleted from Cel9A-68, and this enzyme showed slightly improved filter paper activity and binding to BMCC but otherwise behaved like the wild-type enzyme. The FnIII-like domain was deleted from Cel9A-90, reducing BMCC activity to 43% of the wild type.     

Directed evolution of Bacillus licheniformis lipase for improvement of thermostability

Lipases catalyze the hydrolysis of carboxylic acid esters and owing to their vast substrate specificity, they have many industrial applications. Due to the demand of thermostable lipases in industrial applications, we have enhanced the thermostability of lipase from Bacillus licheniformis RSP-09. The thermostable mutant lipases of Bacillus licheniformis RSP-09 were isolated following two rounds of directed evolution using error-prone PCR. The best mutant lipases obtained after first and second round of error-prone PCR were purified and characterized. The mutant lipases showed increased thermostability and retained catalytic function. The best mutant lipase (eP-231-51) showed 13.5-fold increase in percentage thermal stability (% remaining activity after incubation of purified enzyme at 60 °C for 1 h) than wild-type lipase. Also, this mutant lipase (ep-231-51) showed 30% improved catalytic efficiency compared with the wild-type which is due to significant decrease in K_m and marginal increase in k_cat. In addition, the thermostable mutant lipases have shown resistance to hydrophobic organic solvents. The role of mutations in the best mutant lipases of second round i.e. eP-231-51 (Asp72Gly, Asp61Gly, Tyr129His, and Thr101Pro) and eP-231-137 (Leu49Arg, Thr101Pro, Asp72Gly), that led to thermostability have been postulated after the comparison of molecular models of wild-type and mutated enzymes.     

蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1/SHP-2催化活性域的表达和动力学分析

为了分离纯化SHP-1/SHP-2催化活性域蛋白(分别命名为D1C/D2C), 并估测其动力学常数, 将已经构建好的D1C/D2C重组质粒转化Escherichia coli BL21菌株, 经IPTG诱导表达、菌体裂解缓冲液悬浮和超声波破碎后, 通过HPLC分离纯化D1C/D2C蛋白, 所得产物进行SDS-PAGE电泳检测。然后, 以pY作为去磷酸化反应的底物, 利用孔雀绿显色法, 通过双倒数作图法对纯化的D1C/D2C蛋白进行动力学分析。结果表明, 本试验已成功地表达了D1C和D2C蛋白, 主要以可溶性蛋白的形式表达; 利用HPLC技术可有效地对D1C/D2C蛋白进行分离纯化; D1C的相对分子质量为34.6 kD, 米氏常数Km=2.04 mmol/L, 催化常数Kcat=44.98 s, 特异性常数Kcat/Km=22.05 L/(mmol·s); D2C的相对分子质量为35.3 kD, 米氏常数Km=2.47 mmol/L, 催化常数Kcat=27.45 s, 特异性常数Kcat/Km=11.11 L/(mmol·s); D1C的磷酸酶活性较强于D2C。     

β-脱卤酶的基因克隆表达及其酶学性质

根据GenBank中的序列设计引物,克隆芽孢杆菌中的β-脱卤酶基因(命名为bhd)。以pET30a(+)为载体、Escherichia coli BL21(DE3)-CondonPlus为宿主菌,实现了bhd的高效表达。使用HisTrapTMFF亲和层析柱纯化重组β-脱卤酶,分子量约为23.1 kD。酶学性质研究表明,纯化的重组β-脱卤酶水解3-氯丙酸制备3-羟基丙酸的最适反应体系为30°C,100 mmol/L,pH 7.0的磷酸钠缓冲液。在最适反应条件下,重组β-脱卤酶的比活为16.2 U/mg,Km和Vmax分别为3.26μmol/L和17.86 mmol/(min.g protein)。在最适反应条件下,以10 mmol/L 3-氯丙酸为底物,反应36 h的转化率在93%以上。