黑斑狗鱼部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选

采用磁珠富集与放射性杂交相结合的方法开发黑斑狗鱼(Esoxreieherti Dybowski)基因组微卫星资源。基因组DNA经Sau3AⅠ限制性内切酶消化后,选取400―900bp的片段进行PCR全基因组扩增,并利用生物素标记的(CA)12、(GA)12探针进行微卫星片段的富集。将得到的片段与pGEM-T载体连接后转入DH5α大肠杆菌中,然后利用γ-32P标记的放射性同位素探针进行第二次杂交。结果,共获得微卫星基因组文库1600个菌,杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为90.91%;杂交后得到的阳性克隆为1300个,占87.25%。从中挑出196个进行测序,192(97.96%)个含有微卫星序列。在得到的微卫星序列中,重复单元除CA/GT、GA/CT外,还观察到单碱基、四碱基、五碱基重复单元。根据侧翼序列应用引物设计软件PrimerPremier5.0设计引物70对,选择合成32对,通过优化PCR反应条件,结果有28对引物可扩增出清晰可重复的目的条带。本研究旨在对黑斑狗鱼基因组资源的开发利用起到一定的促进作用,并为黑斑狗鱼养殖品系的优化、遗传多样性的检测及遗传图谱的构建等奠定基础。     

磁珠富集法分离刀鲚微卫星标记

利用磁珠富集法分离微卫星序列,以开发长江刀鲚微卫星分子标记。将长江刀鲚基因组DNA经限制内切酶Mse I酶切,回收400-1 000 bp片段,安装接头,构建长江刀鲚全基因组PCR文库。用生物素标记的微卫星探针(CA)12与其杂交,磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段。将洗脱所得片段进行PCR扩增,然后进行克隆。经过菌落PCR检验后挑选出118个阳性克隆进行测序,其中97条含有微卫星序列。用设计合成59对微卫星引物对30尾养殖长江刀鲚进行引物的多态性筛选,得到9对多态性引物。     

巴氏蘑菇微卫星序列的分离及其对Co60辐射诱变菌株的鉴别

根据链霉素磁珠和生物素特异结合的特性,用生物素标记的二聚核苷酸重复序列探针从巴氏蘑菇的基因组中分离微卫星序列。将结合于链霉素磁珠上的标记探针同两端连接已知序列人工接头的巴氏蘑菇DNA酶切片段杂交。洗脱未杂交DNA片段后,用磁珠富集的片段建立微卫星文库。挑取522个菌落用对应重复序列为引物进行PCR筛选,得到48个阳性克隆,经测序有32个菌落含微卫星序列。微卫星富集效率为阳性克隆数的67%,总克隆数的6%。除去重复或无效的微卫星序列,在设计出的12对用于鉴别85个巴氏蘑菇的Co60辐射变异株微卫星引物中,有4对引物总共扩增出明显的变异菌株17个。证明有些微卫星位点可用于巴氏蘑菇辐射变异品种的指纹筛选与鉴别。     

黑斑原(鱼兆)微卫星DNA富集文库构建与鉴定

采用磁珠富集法,利用生物素标记的(CA)12寡核苷酸探针从黑斑原(鱼兆)基因组DNA MboI酶切的400—1000 bp片段中筛选CA/GT微卫星位点,洗脱的杂交片段克隆到pMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选检测出720个阳性克隆,占所有克隆的89.2%,从阳性克隆中随机选取139个进行测序,序列分析发现,124个克隆含有7个以上的重复序列,其中完全的为80个(64.5%),不完全的为40个(32.3%),复合的为15个(3.2%),重复次数范围为7—165次,平均为52次。在124条序列中共59条可以设计引物。     

伊犁鲈微卫星位点的筛选及近缘物种通用性

为开发伊犁鲈(Perca schrenkii)分子标记用于鲈属鱼类种质资源保护,以伊犁鲈为材料,应用磁珠富集法进行了微卫星标记的筛选.从伊犁鲈尾鳍提取总DNA,进行酶切、接头连接、PCR扩增,再采用生物素标记(CA)15探针及生物素标记(TG)15探针对扩增产物进行杂交富集,经再次PCR扩增及T-A克隆,成功构建了伊犁鲈基因组微卫星富集文库.采用重复序列引物筛选获得阳性克隆,随机选取48个阳性克隆进行测序,测得序列46个,其中38个克隆含有微卫星序列,41个位点的微卫星重复数在8次以上.根据测得序列设计17对微卫星引物,均能在伊犁鲈群体中扩增获得目的条带.采用该17对引物对河鲈(P.fluviatilis)及黄金鲈(P.flavescens)群体样本进行扩增,10对引物具有通用性,其中6对在河鲈中具有高度多态性(PIC>0.5),5对在黄金鲈中具有高度多态性.     

细梢小卷蛾微卫星富集文库的构建与分析

目的:构建细梢小卷蛾Rhyacionia leptotubula微卫星富集文库.方法:提取细梢小卷蛾基因组DNA,经限制性内切酶Rsa Ⅰ酶切,用(CT)10和(GT)10生物素探针与其杂交,利用磁珠富集含有微卫星的DNA序列,并对其进行PCR扩增,将扩增产物连接到pMD18-T载体后转入感受态大肠杆菌DH5α中,得到微卫星富集文库:结果:对100个克隆进行随机测序,获得98个微卫星序列,其中具有5次及以上碱基重复次数的微卫星克隆占26%,最高碱基重复次数为33次,非完美型占12%,说明构建的细梢小卷蛾微卫星富集文库是一个高质量的文库.结论:该文库的建立为后续筛选具高多态性的微卫星标记引物研究细梢小卷蛾的种群遗传结构、迁移扩散规律等奠定了基础.     

东方田鼠部分BAC文库的微卫星筛选

目的 从东方田鼠的部分BAC文库中筛选微卫星.方法 应用非放射性的菌落杂交方法和磁珠富集法从东方田鼠的BAC文库中筛选高质量的微卫星标记.结果 以地高辛标记的寡聚核苷酸(CA)20为探针,通过菌落杂交法从136个东方田鼠BAC克隆中筛选出杂交信号最强的20个阳性克隆.再将这20个阳性克隆分别通过链霉亲和素磁珠法构建亚克隆文库,从中选取400个经PCR鉴定为阳性的亚克隆进一步测序分析,共得到220个微卫星序列,阳性率55％.选取重复次数高,侧翼序列完整的微卫星序列设计74对引物,共有35对引物能扩增出清晰的条带,其中16对引物具有多态性.结论 成功且高效地从阳性BAC克隆中筛选出微卫星序列,这些微卫星和阳性BAC克隆可用于后续的定位研究.     

勒氏笛鲷微卫星位点的筛选及特征分析

采用PCR法快速筛选勒氏笛鲷(Lutjanus russelli)基因组文库, 以获得(CA)_n微卫星位点。勒氏笛鲷基因组DNA经限制性内切酶HaeⅢ+ DraⅠ双酶切后, 连接T-载体克隆, 构建基因组文库。以通用引物M13+/-与重复序列引物(CA)15对基因组文库进行筛选, 二次筛选后得到121个可能含有微卫星位点的阳性克隆。进行序列测定, 共获得53个CA(n≥7)重复序列, 重复次数主要分布于7~15(80.77%)。在所得微卫星序列中, 重复单元除CA外, 还观察到单碱基、三碱基、四碱基、五碱基重复单元。根据侧翼序列设计48对引物, 通过优化PCR反应条件, 可获得清晰可重复的目的条带。研究旨在为勒氏笛鲷遗传多样性研究及遗传图谱的构建等奠定基础, 为勒氏笛鲷资源的合理开发利用提供参考。     

桉树EST序列中微卫星含量及相关特征

通过对桉树属（Eucalyptus）的10000条EST序列进行分析,在其中的1499条序列上共发现1775个微卫星重复序列。含有微卫星的EST序列约占序列总数的15%。此外,还发现桉树EST序列所含微卫星长度的变异速率与重复单元长度呈负相关;微卫星的丰度与重复单元长度也呈负相关（三碱基重复微卫星除外）。在桉树EST序列中,重复单元长度为三碱基的微卫星最为丰富。三碱基重复单元微卫星的过度富集可能是由于遗传密码选择所致。在微卫星的丰度及长度变异方面,桉树EST序列与杨树（Populus trichocarpa）基因组注释的转录序列随重复单元长度的变化呈现出相同的规律,但桉树EST序列中微卫星频率及三碱基重复微卫星的含量显著偏低,推测含微卫星的基因表达丰度极有可能低于不含微卫星的基因。通过对发现的所有微卫星位点进行引物设计,并对设计的引物进行PCR检测,结果表明所设计的引物具有极高的扩增成功率。     

磁珠富集法分离小黄李基因组微卫星DNA片段

将微卫星探针5′端生物素化后与链亲和素磁珠特异结合,用磁珠和探针的结合物与两端连接已知序列人工接头的中国李品种小黄李(Prunus salicinacv.Xiaohuangli)基因组DNA酶切片段杂交,以此杂交片段为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增,根据PCR产物测序结果设计引物作为微卫星DNA的标记引物.结果在随机挑选的36个克隆进行菌落PCR检测时,从31个阳性克隆中挑选18个克隆进行测序后获得了12条特异序列,设计的8对SSR引物均在5个中国李受试品种上获得了预期的扩增产物,其中4对引物在受试品种上表现出多态性.     

基于磁珠富集法的绣线菊SSR分子标记分离与筛选

微卫星序列（SSR）具有多态性高、共显性遗传等特点,是一种极具价值的分子遗传标记。采用磁珠富集法从高山绣线菊基因组DNA中分离和筛选SSR标记。高山绣线菊基因组经限制性内切酶Mse I酶切后与接头连接,并与生物素标记SSR探针（AC）15和（AG）15杂交,然后通过链霉亲和素磁珠富集、洗脱、PCR扩增、克隆,完成微卫星文库构建。利用载体通用引物和探针序列引物进行PCR扩增,筛选重组克隆并测序,获得112条序列。随机挑选其中60条序列设计的引物,经初期筛选获得多态性引物16对。用所得16对引物对4个居群92个个体的蒙古绣线菊和高山绣线菊进行PCR扩增。统计分析PCR产物的毛细管电泳结果,发现4个居群的平均等位基因数、平均期望杂合度及平均观测杂合度都比较高。64个数据系列（4个居群×16个位点）中的26个显著偏离HardyWeinberg平衡,推测可能由于无效等位基因的存在所引起。分析显示研究开发的16对多态性SSR引物可以用于后续遗传多样性、物种进化与亲缘关系等方面研究,丰富了绣线菊遗传多样性研究的分子标记。     

Dynal磁珠富集大熊猫微卫星标记

应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针与大熊猫基因组酶切片段杂交,捕获400—600bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pGEM-T载体中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库。应用γ^32P标记的探针筛选文库,从2880个转化子中获得了260个阳性克隆。对54个序列进行了测序,并成功地设计了大熊猫微卫星引物37对。该方法能有效提高筛选微卫星标记的效率。     

藏酋猴微卫星富集文库的构建及微卫星分子标记的筛选

通过磁珠富集法构建了藏酋猴AC重复和AAAG重复的微卫星富集文库,分离微卫星序列并对其进行分析。将藏酋猴基因组DNA经Sau3AI酶切后纯化回收,连接特定接头。用生物素标记的探针与酶切片段杂交,捕获300～1000bp片段,随后将获得的片段连接到pMD-19T载体上,转化至JM109中,成功构建藏酋猴微卫星富集文库。(AC)n富集文库和(AAAG)n富集文库的阳性克隆率分别为50%和10%左右。根据测序得到的48个微卫星序列成功设计了24对引物,最终筛选出6个微卫星标记,这些标记将为藏酋猴的遗传多样性研究、圈养种群结构的分析和遗传图谱的构建等奠定一定的基础。     

藏鸡微卫星文库的构建与微卫星标记筛选

通过磁珠富集法构建了藏鸡基因组微卫星富集文库,分离微卫星序列并对其进行分析.将藏鸡基因组DNA经Sau3AI酶切后纯化回收,连接特定接头.用生物素标记的(CA)12探针与藏鸡基因组酶切回收片段杂交,捕获200～900 bp片段,随后将获得的片段连接到pMD 18-T载体上,转化至JM109中,成功构建藏鸡微卫星富集文库.从1200个转化子中获得了353个阳性克隆,随机挑选53个测序,根据测序结果成功设计了18对藏鸡微卫星引物,最终筛选出6个具有多态性的微卫星标记,其PIC值均大于0.5,同时可以用于研究藏鸡遗传多样性.实验结果表明磁珠富集法能够有效提高分离微卫星标记的效率.     

磁珠富集法筛选实验豚鼠微卫星分子标记

目的直接从实验豚鼠基因组DNA中筛选获得微卫星分子标记。方法应用磁珠和生物素标记的微卫星探针与豚鼠基因组酶切片段杂交,捕获200～1000 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD-18V载体中,转化到感受态细胞E.coli DH5α中构建富集微卫星序列的小片段插入文库。然后用PCR法进行筛选。结果从约2000个转化子中获得240个阳性克隆。对其中98个进行了测序,并成功设计豚鼠微卫星引物17对。结论经过优化的磁珠富集法能够稳定、高效地获得豚鼠微卫星标记。本研究获得的微卫星位点将成为豚鼠遗传学研究的有力工具。     

岩原鲤微卫星富集文库的构建及微卫星分子标记的筛选

用磁珠富集法构建了岩原鲤Procypris rabaudi AC重复和GATA重复的微卫星富集文库.采用PCR方法分别以人工合成的oligoA和探针(AC)12或(GATA)6为引物筛选含有微卫星的阳性克隆.(AC)n 富集库和(GATA)n富集库的阳性克隆率分别为30%和7%左右.对40个AC重复的阳性克隆和30个GATA重复的阳性克隆测序,共获得61个微卫星序列,其中包含了一个三碱基重复(TGA)的微卫星序列.选择设计了19对AC重复和16对GATA重复的微卫星引物以及1对TGA重复的微卫星引物,通过PCR优化,共有20对引物能够产生稳定、清晰的目的产物带.为了检测获得的岩原鲤微卫星座位是否能用于近缘物种的研究,我们将20对岩原鲤微卫星引物用于中华倒刺鲃Spinibarbus sinensis基因组DNA PCR扩增,有60%的引物对能产生特异性的目的条带.本研究获得的20个岩原鲤微卫星座位可以用于岩原鲤及近缘物种的遗传多样性、种群遗传结构等的进一步研究.     

曼氏无针乌贼GT微卫星位点的筛选

采用链霉亲和素包被的磁珠富集法筛选曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)微卫星位点。试验样品来自舟山六横岛,提取4个样品的DNA混合成DNA pool,用限制性内切酶Sau 3A I酶切。接上接头后构建基因组PCR文库,用生物素标记的(GT)15探针筛选。将筛选获得目的片段进行PCR扩增,连接pMD18-T载体,转入DH5α感受态大肠杆菌里,扩大培养后PCR筛选阳性克隆。总共选取278个克隆,对120个经过检测含有插入片段的克隆进行测序,发现102个克隆含有微卫星序列,阳性克隆比率为85%。除去重复测序和侧翼链不足的序列,可以设计引物的微卫星序列有64条。     

一种筛选微卫星位点的改进方法及其在小熊猫微卫星基因文库构建上的应用

微卫星（Simple Sequence Repeat,SSR）基因位点是在各个遗传学领域被广泛使用的分子标记。而对于首次研究的物种,必须筛选出可以应用的微卫星位点。对于分离微卫星位点来说由于只有大约0.5％-2%的重组体含有微卫星位点,所以标准的基因组文库需要至少产生5 000个重组体。传统的筛选方法就是通过检测大量重组体来定位这些少量的位点。近几年来出现了一些新的筛选方法,采用“富集”微卫星序列的技术将包含微卫星位点的重组体比例提高了10-100倍。这样就降低了筛选工作的时间和劳动强度,大大提高了筛选微卫星位点的效率。本文在结合了几种筛选微卫星位点技术路线的基础上,采用生物素标记探针杂交、富集和PCR筛选技术,对原有技术路线进行了改进。主要试验步骤为：1）基因组DNA的提取和消化;2）生物素标记探针富集;3）克隆建库;4）“PCR”筛选;5）引物设计和多态性检测。新的方法在小熊猫微卫星基因文库的构建中取得成功,获得了10个具有多态性的(CA)n重复序列微卫星位点。     

背角无齿蚌基因组(GT)n微卫星DNA特征

利用磁珠富集法筛选背角无齿蚌(Anodonta woodiana)的微卫星分子标记,采用Sau3A1酶对完整DNA进行酶切,以生物素标记的(GT)15寡核苷酸探针从酶切片段中筛选微卫星序列.洗脱的杂交片段克隆到PGEM-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过菌液PCR筛选检测出阳性克隆进行测序.结果表明:在筛选的18...     

桉树EST序列中微卫星含量及相关特征

通过对桉树属(Eucalyptus)的10 000条EST序列进行分析, 在其中的1 499条序列上共发现1 775个微卫星重复序列。含有微卫星的EST序列约占序列总数的15%。此外, 还发现桉树EST序列所含微卫星长度的变异速率与重复单元长度呈负相关; 微卫星的丰度与重复单元长度也呈负相关(三碱基重复微卫星除外)。在桉树EST序列中, 重复单元长度为三碱基的微卫星最为丰富。三碱基重复单元微卫星的过度富集可能是由于遗传密码选择所致。在微卫星的丰度及长度变异方面, 桉树EST序列与杨树(Populus trichocarpa)基因组注释的转录序列随重复单元长度的变化呈现出相同的规律, 但桉树EST序列中微卫星频率及三碱基重复微卫星的含量显著偏低, 推测含微卫星的基因表达丰度极有可能低于不含微卫星的基因。通过对发现的所有微卫星位点进行引物设计, 并对设计的引物进行PCR检测, 结果表明所设计的引物具有极高的扩增成功率。