大熊猫遗传多样性评估的微卫星分型体系优化

微卫星作为重要的分子标记之一,已被证明在大熊猫种群规模评估、亲子鉴定和遗传多样性分析方面是有效的。目前微卫星标记在大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)染色体上物理定位方面的报道较少,而且缺乏微卫星基因分型系统的效能评估以及PCR扩增条件的优化。本研究基于大熊猫基因组参考序列(ASM200744v2),分析了34个大熊猫微卫星位点的染色体定位特征并评价了位点的应用价值。通过优化34个STR-PCR反应体系和扩增程序,结合微卫星的染色体定位数据确定了Ame-μ10标记的较低应用价值以及gpz-6重新筛选引物的必要性。本研究有助于提高基因分型结果的重复性和可靠性,对促进《大熊猫种群遗传档案建立技术规程》规范化应用和制定大熊猫保护策略具有重要意义。     

适用于种群遗传管理的小熊猫微卫星亲子鉴定体系的建立

由于标记缺失、生产记录不详、亲权关系不明及部分个体来源不清等历史问题,中国小熊猫圈养种群存在谱系错漏、近亲繁殖等风险。近年来,随着小熊猫种群规模不断扩大,管理者们对谱系的准确性提出了更高的需求,亲子鉴定工作也成为了研究的重点。本文采用26个微卫星标记,对国内3个小熊猫圈养种群进行了亲缘关系运算,完成了相关谱系的查错与整理。26个位点多态性与稳定性良好,联合非亲排除概率达到0.9999以上,可解决国内小熊猫圈养种群的各类亲子鉴定需求。在单亲未知或双亲未知的情况下,8或11个位点组合可实现亲子鉴定。5个位点组合可进行个体识别。在小熊猫圈养管理过程中,应用一套亲子鉴定体系对小熊猫圈养的谱系进行查漏补缺,有利于制定科学的配对计划、避免近亲繁殖,对小熊猫种群保护有着重要意义。     

大熊猫多态性微卫星标记筛选

选用前人分离得到的42对大熊猫微卫星引物,分别用圈养大熊猫的血液DNA和野生大熊猫的粪便DNA对其进行PCR扩增,并比较琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测结果。结果表明,不同标记的多态性差异较大,筛选出13对能较好地应用于大熊猫遗传多样性研究的微卫星引物。     

华南虎、东北虎、孟加拉虎的D-loop和ND5序列及其在系统进化分析中的应用

本文采用PCR和质粒克隆测序方法,获得了华南虎线粒体D-loop区的480 bp序列和东北虎、孟加拉虎线粒体D-loop区的503 bp序列;同时还获得了这三个虎亚种和金钱豹线粒体ND5基因5'端309 bp的部分序列.根据D-loop序列分析,华南虎与孟加拉虎、东北虎的平均距离(p-distance)分别为0.110 88和0.110 87,而东北虎与孟加拉虎间的平均距离为0.009 94;根据ND5序列分析,华南虎与孟加拉虎、东北虎的平均距离分别为0.114 34和0.117 58,而东北虎与孟加拉虎间的平均距离为0.003 24.三个虎亚种的mtDNA D-loop和ND5序列比较表明,华南虎是这三个虎亚种中最为古老的亚种.     

华南虎、东北虎、孟加拉虎的D-100p和ND5序列及其在系统进化分析中的应用

本文采用PCR和质粒克隆测序方法,获得了华南虎线粒体D-loop区的480bp序列和东北虎、孟加拉虎线粒体D-loop区的503bp序列;同时还获得了这三个虎亚种和金钱豹线粒体ND5基因5’端309bp的部分序列。根据D-loop序列分析,华南虎与孟加拉虎、东北虎的平均距离(p-distance)分别为0．11088和O．11087,而东北虎与孟加拉虎间的平均距离为0．00994;根据ND5序列分析,华南虎与孟加拉虎、东北虎的平均距离分别为0．11434和0．11758,而东北虎与孟加拉虎间的平均距离为0．00324。三个虎亚种的mtDNA D-loop和ND5序列比较表明,华南虎是这三个虎亚种中最为古老的亚种。     

幼年早期和成年大熊猫胰腺组织miRNA初步研究

大熊猫Ailuropoda melanoleuca是独特的食肉目Carnivora动物,幼年早期以母乳为食,成年却严格以竹子为食.为探究microRNA(miRNA)对大熊猫幼年早期及成年营养利用及代谢的调控作用,对2只幼年早期和2只成年大熊猫的胰腺组织进行了small RNA测序分析,鉴定了202个保守miRNA和8...     

使用SPE软件筛选绿尾虹雉微卫星引物及其在亲缘关系鉴定上的应用

圈养绿尾虹雉Lophophorus lhuysii多为一雄配多雌,但由于雄鸟更换,雌鸟产蛋期交错,且无特定产蛋位,导致亲子关系难以确认。本研究从绿尾虹雉基因组中广泛筛选微卫星位点,得到13对引物。采用微卫星PCR引物特异性鉴定程序（SPE）对引物序列进行评估,排除1例PCR产物长度相近的特殊多位点扩增。利用获得的12个微卫星标记在18份绿尾虹雉蛋壳/羽毛DNA样品中进行遗传多样性分析,同时以其中15份蛋壳样品（2018—2019年搜集）为检材,进行了亲缘（同胞）关系鉴定。结果表明,这12个微卫星标记可用于绿尾虹雉亲缘关系的鉴定,对提高小种群的维持能力,保持种群遗传多样性具有重要意义。     

大熊猫生长分化因子9(GDF-9)基因克隆与序列分析

生长分化因子9(GDF-9)是转化生长因子β(TGF-β)超家族的一个新成员,主要表达于卵母细胞,调节卵泡早期发育. 本文以大熊猫基因组DNA为模板,克隆了大熊猫GDF-9基因.序列分析显示:大熊猫GDF-9基因含两个外显子,编码一个由453个氨基酸组成的蛋白前体.该结果为进一步分析大熊猫GDF-9基因生物学功能奠定了基础.     

川金丝猴胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因的克隆及序列分析

本实验从金丝猴肝脏细胞RNA中反转录得到cDNA,利用设计的引物M1和M2扩增IGF-Ⅰ基因,并将其克隆到pGEM-T载体上。经筛选、酶切、PCR鉴定、序列分析,证明该片段为金丝猴IGF-Ⅰ基因的cDNA克隆。该片段由521个核苷酸组成,其中包括一个完整的开读框（ORF）,编码一个由153个氨基酸组成的多肽。与GenBank中人、猪、鼠、马、牛、兔、山羊等哺乳动物的IGF-Ⅰ序列比较,其编码成熟肽序列的同源性从93．8％（马）到88．6％（鼠）,开放框序列的同源性从94．4％（人）到88．5％（鼠）。     

通过二代测序技术开发25个小熊猫的微卫星位点

采用Roche 454基因组测序平台在小熊猫Ailurus fulgens的基因组中进行测序拼装,得到了大量含有微卫星片段的序列。本文选择了其中467条序列设计引物,筛选出了115个微卫星位点,最终选出25个微卫星位点,重复单元包含TAT、GATA、AAACA、AAAACA等,并应用到42只小熊猫个体上进行了分型。观察到的等位基因数为3～10;观察杂合度和期望杂合度分别为0. 143～0. 929和0. 136～0. 869;多态信息含量为0. 128～0. 843,经检测所有位点均未偏离哈迪-温伯格平衡。这些微卫星位点可应用于小熊猫圈养种群的遗传管理,在未来还可进一步作为小熊猫的种群遗传学等研究的有力工具。