应用微卫星标记研究Dunkin Hartley豚鼠封闭群的遗传背景

目的检测我国现有Dunkin Hartley豚鼠封闭的遗传背景,分析评估其遗传多样性水平和遗传分离情况,为建立标准化的豚鼠封闭群监测方法提供基础资料。方法应用筛选获得的8个微卫星位点,从一个数量为1000的豚鼠封闭群中随机选择72个个体,通过PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法,进行等位基因检测。并根据检测结果分析评估了该豚鼠封闭群的遗传现状。结果共检测到28个等位基因,每个座位的等位基因数为2～5个,有效等位基因数为1.5191～3.4422,平均2.3093。平均期望杂合度为0.5294。各位点多态信息含量在0.3154～0.6545之间,平均值为0.4687。有5个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡。结论豚鼠封闭群的遗传多态性处于中等水平,遗传平衡检测结果提示种群的繁殖过程未能实现完全随机交配,近交现象一定程度上存在。本研究的结果将为豚鼠封闭群遗传监测方法和标准的建立提供基础。     

WHBE 兔、日本大耳白兔和新西兰兔遗传多样性的 RAPD 分析

目的：应用随机引物扩增多态性DNA技术（ random amplified polymorphic DNA , RAPD）对大耳白黑眼兔（ white hair black eyes rabbit , WHBE rabbit ）、日本大耳白兔（ Japanese white rabbit , JW rabbit ）和新西兰兔（New Zealand white rabbit, NZW rabbit）3个实验兔品系进行遗传分析。方法选用90只实验兔的皮肤组织样品提取基因组DNA,用60个随机引物对实验兔基因组DNA进行PCR扩增,根据电泳结果筛选出多态性较高的引物进行RAPD-PCR分析,再利用Popgene 3．2统计软件对3个品系的扩增条带进行遗传分析,获得实验数据。结果分析结果表明：（1）60个随机引物中筛选出25个多态性较高的引物,3个品系实验兔共检测到493个扩增片段,长度在100～1800 bp之间,筛选的25个引物中,其中16个引物既可扩增出3个品系共同的DNA条带,也可扩增出WHBE兔特有的特征条带;（2） WHBE兔位点数为234个,其中多态位点数166个,多态位点比为70．94％,JW兔位点数为228个,其中多态位点数122个,多态位点比为53．51％,NZW兔位点数为231个,其中多态位点数94个,多态位点比为40．69％;（3）三个群体的Shannon多样性指数分别为0．3385,0．2222和0．1905;（4） JW兔和NZW兔的遗传相似系数最高,为0．8443,其次为WHBE兔和JW兔的遗传相似系数,为0．8204,WHBE兔和NZW兔的遗传相似系数最低,为0．7862。结论结果表明WHBE兔与JW兔和NZW兔之间有遗传的相似性,也存在着遗传差异,应用RAPD技术可以很好地检测实验兔不同品系之间以及同一品系不同个体之间的亲缘关系。     

微卫星技术在大耳白黑眼兔近交系培育中的监测分析

利用微卫星技术监测大耳白黑眼兔(white hair black eyes rabbits,WHBE兔)近交培育中第五代(F5)、第六代(F6)和第七代(F7)的遗传多样性.选取21个微卫譬座位,筛选出扩增产物稳定并且具有多态性的11对微卫星引物用于本研究.结果表明,F5代WHBE兔在每个座位上的等位基因数(Na)为3～9个不等,11个座位的平均有效等位基因数(Ne)为1.81个,平均观察杂合度(Ho)和平均多态信息含量(PIC)分别为0.381和0.524,累积个体识别率(CDP)达到100%,累积非父排除概率(CPE)在双亲信息都是未知情况下的为0.926,而在得知任一亲本信息的情况F,CPE值为0.993.F6代WHBE兔在每个座位上的Na为3～8个不等,11个座位的平均Ne为1.68个,平均Ho和PIC值分别为0.356和0.548,CDP达到100%,CPE在双亲信息都是未知情况下的为0.931,而在得知任一亲本信息的情况下,CPE值为0.994.F7代WHBE兔在每个座位上的Na为2～6个不等,11个座位的Ne为1.51个,平均Ho和PIC值分别为0.287和0.498,CDP达到100%,CPE在双亲信息都是未知情况下的为0.891,而在得知任一亲本信息的情况下,CPE值为0.986.在近交系培育过程中,从F5代到F7代,WHBE兔的平均Ne和平均Ho 都呈下降趋势,提示随着近交代数的增加,WHBE兔的基因纯合度越来越高.     

白毛黑眼兔眼部虹膜Trp1、Trp2基因克隆与分析

目的 克隆日本大耳白兔白毛黑眼系(白毛黑眼兔)眼部虹膜Trp1、Trp2基因,获取其完整的外显子序列.进一步推测这两个基因编码的蛋白,并分析其特征.方法 从白毛黑眼兔的黑色虹膜组织中提取RNA,并反转录成cDNA.利用来自小鼠、大鼠和人的同源引物,扩增获得白毛黑眼兔Trp1、Trp2基因外显子片段.然后对已知片段进行3' RACE和5'RACE,从而获得白毛黑眼兔Trp1、Trp2基因外显子完整序列.利用相关软件对获得序列进行翻译和分析.结果 首次获得了白毛黑眼兔Trp1、Trp2基因外显子全序列.该实验兔Trp1基因的编码序列全长1604个碱基,其核苷酸序列与人的相似度为87.9％,与小鼠的相似度为82.7％.TRP1成熟蛋白包含513氨基酸,氨基酸序列与人的相似度为89.8％,与小鼠的相似度为86.6％.该实验兔Trp2基因序列全长1554个碱基,其核苷酸序列与人的相似度为83.2％,与小鼠的相似度为81.9％.TRP2成熟蛋白包含494个氨基酸,其序列与人的一致度为84.2％,与小鼠的一致度为84.4％.结论 本研究获得的TRP1、TRP2的序列与已知的家兔酪氨酸相关蛋白家族成员TYR的序列进行比对,结果显示这三种蛋白之间有较高的相似度,并且TRP1和TRP2蛋白序列表现出了酪氨酸酶家族结构上的保守性和特有的结构特征.     

主动脉弓缩窄诱导大鼠心肌肥大Raf/MEK/ERK通路的变化

目的:通过观察心肌肥大大鼠加速纤维肉瘤/丝裂素活化蛋白激酶激酶/胞外信号调节蛋白激酶(Raf/MEK/ERK)通路关键因子的基因和蛋白表达及蛋白磷酸化修饰水平上的变化,了解Raf/MEK/ERK通路在心肌肥大调控中的作用。方法: 20只SD大鼠随机分为假手术组和模型组,通过主动脉弓缩窄(TAC)法建立心肌肥大模型,12周后颌下静脉取血分离血清,检测氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)含量,之后进行超声心动图测定和麻醉下的血流动力学测定,收集心肌标本,观察心肌组织的病理学改变,检测心肌组织Raf/MEK/ERK通路的关键因子基因、蛋白表达水平及蛋白磷酸化水平的变化。结果:与假手术组比较,TAC模型组大鼠超声心动图的左室舒张末期室间隔厚度(IVSd)、左室收缩末期室间隔厚度(IVSs)、左室后壁舒张末期厚度(LVPWd)、左室后壁收缩末期厚度(LVPWs)显著增厚(P＜0.05,P＜0.01),左室收缩末期内径(LVIDs)显著减小(P＜0.01),左心室质量(LV Mass)、左心系数LW(LV Mass/Weight)比值显著增加(P＜0.05,P＜0.01);大鼠心率(HR)、左心室最大收缩速率(+dp/dtmax)、左心室最大舒张速率(-dp/dtmax) 均显著降低(P＜0.01),血清中NT-pro BNP含量显著增加(P＜ 0.01);心肌细胞排列杂乱,心肌细胞肥大、胞质明显增多,炎症细胞浸润,出现大量胶原纤维沉积,大面积心肌细胞呈现蓝色;大鼠心肌组织中c-Raf在Ser259和Ser338上的磷酸化蛋白phospho-c-Raf (Ser259)和phospho-c-Raf (Ser338) 表达水平显著升高(P＜0.01),其下游MEK1/2、ERK1/2的磷酸化蛋白phospho-MEK1/2(Ser217/Ser221)和phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)表达水平也显著增高(P＜0.01)。结论: Raf/MEK/ERK通路在心肌肥大中的调控作用,可能通过激活关键因子c-Raf、MEK1、MEK2、ERK1和ERK2特异性位点的磷酸化实现的。     

不同方法建立的人大细胞肺癌裸鼠移植瘤模型的生物学特点

目的比较三种常用的皮下移植瘤造模方法建立的人大细胞肺癌NCI-H460裸鼠移植瘤模型的不同生物学特点,为不同的研究寻找合适的造模方法提供实验依据。方法分别用NCI-H460细胞,NCI-H460移植瘤组织块和移植瘤匀浆液对于BALB/c-nu/nu裸鼠建立皮下移植瘤模型,运用一般生物学指标观察三种移植瘤的成瘤率、瘤重、倍增时间和组织形态;采用全自动生化分析仪检测其外周血中丙氨酸氨基转氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血糖（G1u）、尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）等生化指标;利用血球分析仪检测白细胞总数（WBC）并进行分类,最后体外对其腹腔巨噬细胞吞噬活性和NK细胞活性进行了考察。结果本实验中细胞法和匀浆法的成瘤率及肿瘤生长速率显著高于埋块法且其生长更为均一,差异较小。接种5周后,与正常裸鼠比较,三组荷瘤小鼠血液中ALT、AST显著升高,BUN、CREA显著降低,埋块组的AST和BUN两项指标显著高于其他两荷瘤组。此外,接种2周后,荷瘤裸鼠的GLU显著低于正常裸鼠,匀浆液组的GLU降得最低。白细胞中,三种方法组荷瘤小鼠血液中LYM%、MN%、HGB均有降低,匀浆液组和细胞培养组的荷瘤小鼠血液中WBC、NEUT%、PLT显著高于埋块组。免疫细胞活性方面,两种细胞均呈现出正常细胞组〉匀浆组〉细胞组〉埋块组的趋势。结论细胞培养法接种数量可控,肿瘤生长均匀,适合建立不同实验需求的移植瘤模型,组织块移植法适于建立中药抗肿瘤筛选的动物模型,而匀浆液移植法则不推荐使用。裸鼠的生理生化状态和免疫功能与肿瘤的生长有密切的关系。     

不同血瘀造模对B_(16)荷瘤鼠肝转移模型的影响

目的比较不同血瘀造模对B16荷瘤鼠肝转移模型的影响。方法取60只6周龄雌性C57BL/6J小鼠,随机分为正常对照组、单纯荷瘤组、BS1(利血平法)组、BS2(游泳复合高分子右旋糖酐法)组、BS3(寒凝复合肾上腺素法)组和BS4(地塞米松复合肾上腺素法)组,首先根据中医理论用不同造模方法形成血瘀模型,然后经脾接种B16黑色素瘤建立肝转移模型。用激光多普勒观察小鼠耳廓微循环变化,并在接种后第15天小鼠眼眶取血,检测红细胞免疫功能和血清唾液酸酶(SA)含量的变化,并麻醉处死动物,观察肝转移情况。结果①单纯荷瘤组和各血瘀荷瘤组小鼠的耳廓微循环血流均明显减少(P0.01),以BS2组降低显著。②单纯荷瘤组和各血瘀荷瘤组小鼠的红细胞免疫功能亦明显降低(P0.01),血清SA含量显著升高(P0.05,P0.01),以BS2和BS3组变化明显。③肝转移发生率:单纯荷瘤组、BS2组和BS3组均为100%,BS1组为80%,BS4组为60%,肝转移抑制率:BS2组、BS3组、BS1组和BS4组分别为-71.76%、3.90%、16.42%、100.6%。④荷瘤鼠肝转移的肝重与其耳廓微循环血流、红细胞免疫功能和唾液酸酶含量具有显著的相关性(P0.05,P0.01)。结论不同血瘀造模对B16荷瘤鼠肝转移模型肝转移发生程度具有明显的影响,应注意血瘀模型的选择,且其与红细胞免疫功能低下有关。     

白毛黑眼兔等四种实验兔黑色素分布的组织学观察与比较

目的：分析包括白毛黑眼兔在内的四个品种实验兔的虹膜和皮肤组织中的黑色素分布情况和相互之间的差异。方法通过组织切片和硫酸亚铁染色,对四个品种实验兔的虹膜和皮肤组织中的黑色素含量和分布进行了观察与比较。结果与其背景白化品种相比,白毛黑眼兔不仅在虹膜组织中出现了类型完整的黑色素,而且在其表型为白色的皮肤的毛囊中也出现了低含量的黑色素。结论本结果为白毛黑眼兔突变表型机理研究提供了一定线索。     

不同品种实验兔虹膜酪氨酸酶基因序列和表达量的变化

目的从酪氨酸酶基因序列和表达量两个方面探讨酪氨酸酶与家兔虹膜颜色表型的关系。方法通过PCR扩增和测序检测4个具有不同颜色性状的家兔品种的酪氨酸酶基因外显子序列多态性;通过荧光定量PCR检测酪氨酸酶基因表达水平。结果白化品种日本大耳白兔和獭兔的TYR基因序列在第1118个碱基处都由C突变为A,并导致编码蛋白在373位,即最后一个N-糖基化位点发生由Thr到Lys的突变。白毛黑眼兔和青紫兰兔在第870个碱基处全部发生由A到T的无义突变。在白毛黑眼兔种群的所有个体和獭兔种群的部分个体中都发现TYR基因序列在第91个碱基处发生G到A的突变,导致氨基酸序列第31位处Val到Met的变异。经内参基因GAPDH的校正,TYR基因在白毛黑眼兔和青紫兰兔中表达水平显著高于在日本大耳白兔和獭兔中的表达水平（P〈0.01）。而在白毛黑眼兔和青紫兰兔之间、日本大耳白兔和獭兔之间,TYR基因的表达差异没有显著性。结论家兔TYR基因突变可能大幅度降低TYR基因表达,导致酪氨酸酶功能低下,从而影响虹膜颜色表型。     

不同因素致亚健康大鼠血液生化、血气电解质指标的影响

目的观察不同因素致亚健康模型大鼠血液生化和血气电解质指标的变化。方法 60只雄性Wistar大鼠随机分为5组,即多因素（MF）组、热水游泳（WS）组、睡眠不足（SD）组、单纯束缚（PC）组和正常对照（C）组,每组12只。采用热水游泳、睡眠剥夺和单纯束缚等单因素或多因素联合建立亚健康大鼠模型,各组造模5d后,处死6只,剩余动物进行恢复性饲养3 d后处死。分别测定造模结束后和恢复3 d时大鼠的血清中的丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、血糖（GLU）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、肌酸磷酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）和血气电解质等指标。结果 （1）与正常对照（C）组比,造模5d后MF组的大鼠BUN和TG水平显著降低（P〈0.05,P〈0.01）,同时CREA、AST、CK、CK/AST和LDH水平显著升高（P〈0.01）,WS组的大鼠TC、CK、CK/AST和LDH水平亦升高显著（P〈0.01）,且各模型组的大鼠GLU浓度明显增加（P〈0.01）;恢复3 d后,MF组的大鼠TC、AST、ALT、ALB、BUN、CK、CK/AST和LDH水平均明显高于C组（P〈0.05,P〈0.01）;WS组的大鼠血清AST、CK、CK/AST比值和LDH水平亦显著高于C组（P〈0.01）,SD组的大鼠CK显著高于C组（P〈0.05）;（2）与C组比,造模5d后MF组、SD组和PC组的大鼠PCO2、Hct和Hb均明显升高（P〈0.05,P〈0.01）,WS组Hct和Hb升高显著且Na＋显著降低（P〈0.01）,MF组的大鼠PO2和SO2%均显著降低且K＋明显升高（P〈0.05）,且各造模组的大鼠HCO3-♂的浓度均显著升高（P〈0.05,P〈0.01）;恢复3 d后,除各造模大鼠的血液pH值和PO2均明显下降（P〈0.05,P〈0.01）外,MF组、SD组和PC组的大鼠PCO2升高并伴有SO2%的降低（P〈0.05,P〈0.01）,MF组和WS组Na＋仍明显低于C组（P〈0.05,P〈0.01）,SD组的大鼠K＋和Mg2＋则明显高于C组（P〈0.05,P〈0.01）。结论不同因素诱导的亚健康状态大鼠的血液生化、血气电解质指标均出现了不同程度上的改变,故血液生化和血气电解质指标能有效评估亚健康状态机体血液微环境的改变。