黑斑狗鱼部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选

采用磁珠富集与放射性杂交相结合的方法开发黑斑狗鱼(Esoxreieherti Dybowski)基因组微卫星资源。基因组DNA经Sau3AⅠ限制性内切酶消化后,选取400―900bp的片段进行PCR全基因组扩增,并利用生物素标记的(CA)12、(GA)12探针进行微卫星片段的富集。将得到的片段与pGEM-T载体连接后转入DH5α大肠杆菌中,然后利用γ-32P标记的放射性同位素探针进行第二次杂交。结果,共获得微卫星基因组文库1600个菌,杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为90.91%;杂交后得到的阳性克隆为1300个,占87.25%。从中挑出196个进行测序,192(97.96%)个含有微卫星序列。在得到的微卫星序列中,重复单元除CA/GT、GA/CT外,还观察到单碱基、四碱基、五碱基重复单元。根据侧翼序列应用引物设计软件PrimerPremier5.0设计引物70对,选择合成32对,通过优化PCR反应条件,结果有28对引物可扩增出清晰可重复的目的条带。本研究旨在对黑斑狗鱼基因组资源的开发利用起到一定的促进作用,并为黑斑狗鱼养殖品系的优化、遗传多样性的检测及遗传图谱的构建等奠定基础。     

黑斑狗鱼部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选(英文）

采用磁珠富集与放射性杂交相结合的方法开发黑斑狗鱼（Esox reieherti Dybowski）基因组微卫星资源。基因组DNA 经Sau 3AⅠ限制性内切酶消化后，选取400―900 bp的片段进行PCR全基因组扩增，并利用生物素标记的（CA）12、（GA）12 探针进行微卫星片段的富集。将得到的片段与pGEM-T载体连接后转入DH5α大肠杆菌中，然后利用γ-32 P标记的放射性同位素探针进行第二次杂交。结果，共获得微卫星基因组文库1 600个菌，杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为90.91%；杂交后得到的阳性克隆为1 300个，占87.25%。从中挑出196个进行测序，192（97.96%）个含有微卫星序列。在得到的微卫星序列中，重复单元除CA/GT、GA/CT 外，还观察到单碱基、四碱基、五碱基重复单元。根据侧翼序列应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物70对，选择合成32对，通过优化PCR反应条件，结果有28对引物可扩增出清晰可重复的目的条带。本研究旨在对黑斑狗鱼基因组资源的开发利用起到一定的促进作用，并为黑斑狗鱼养殖品系的优化、遗传多样性的检测及遗传图谱的构建等奠定基础。     

仿刺参基因组DNA提取方法改进

开发了利用仿刺参管足活体取样提取基因组DNA的方法。按照传统方法提取仿刺参基因组DNA需要杀死实验对象并剖取体腔内纵肌(通常100mg)作为实验材料,并且实验过程中常常因为仿刺参的生物学性状而影响最终实验效果。以仿刺参在生活状态下拔取少量管足(10～20mg即可)作为取样源,在保持仿刺参的生活力不受影响的同时提高了取样效率。对仿刺参基因组DNA的提取方法进行了改进优化,并在常规海洋动物基因组DNA提取方法的基础上增加了部分操作步骤。与常规的基因组DNA提取方法相比,改进后的方法获取的基因组DNA完全符合后续实验要求。而且可随时根据即时效果(中间检测)和后续实验要求调整实验步骤,更增加了实验的可操作性。