三角帆蚌LRR基因的分子特征及表达分析

近年来珠蚌养殖业一直饱受病害困扰,现有资料表明富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat,LRR)蛋白在无脊椎动物的蛋白互作、识别过程和免疫反应中都起到至关重要的作用,本实验通过RACE法克隆并表达了三角帆蚌LRR基因,全长为3 492 bp,其中开放阅读框2 142 bp,编码713个氨基酸,其中5个氨基酸组成信号肽,而其余688个氨基酸则形成成熟肽,氨基酸序列经相关软件预测存在跨膜结构。运用荧光定量PCR技术分析LRR在正常组织中及受到嗜水气单胞菌侵染后相关组织表达量的变化,分析发现,在非胁迫状态下,LRR基因在斧足中高表达,在其他组织中几乎不表达。嗜水气单胞菌刺激侵染后可以看到斧足和肝胰腺中LRR基因表达显著下调,而其他组织表达量在不同时间点均出现表达峰值,显示能被显著诱导,说明LRR基因表达可能与抵挡病原体入侵有关。     

RNA干扰沉默三角帆蚌HcCA3基因对贝类矿化作用的影响

为探究三角帆蚌基质蛋白基因Hc CA3的功能,本研究根据Hc CA3基因的c DNA全长序列,设计并合成特定的干扰链(si RNA),将干扰链注射到三角帆蚌闭壳肌内,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测Hc CA3基因在外套膜不同部位即前端缘膜(amp)、后端缘膜(pmp)和中央膜(mc)的表达变化。在RNA干扰预实验中,筛选了三条目的基因干扰链,其中si RNA-Hc CA3-1干扰链干扰效果最好;同时筛选了4条阴性对照链,发现Hc CA3基因在注射不同的阴性对照链的各个组织中的表达均呈现不同程度的显著性下降,并没有筛选到合适的阴性对照链。在RNA干扰正式实验中,随着累计注射干扰链si RNA-Hc CA3-1,Hc CA3基因在前端缘膜和后端缘膜内出现了相似的表达特征,12 d出现了敲降作用(分别为对照组的28%和30%),Hc CA3基因在中央膜中表达从12 d开始显著下降(为对照组的84%),18 d为对照组的76%。本实验通过累积注射si RNAHc CA3-1,成功的抑制了Hc CA3基因在外套膜不同部位的表达,推测该基因参与了贝壳和珍珠的矿化,为进一步研究Hc CA3基因的功能提供了基础。     

三角帆蚌五个野生群体线粒体DNA 16S rRNA遗传特性

对中国主要淡水湖泊(鄱阳湖、洞庭湖、太湖、洪泽湖及巢湖)三角帆蚌5个野生群体的线粒体DNA 16S rRNA基因片段进行了扩增和测序,得到473bp的碱基序列,没有发现插入/缺失突变的核苷酸位点。检测到了32个多态性核苷酸位点,共7种单倍型。鄱阳湖群体的222(C→G)和325(A→G)位点,太湖群体的233(A→G)位点,巢湖群体的40(A→G)、138(A→T)和294(C→T)位点,洪泽湖群体的241(A→C)位点的变异可以作为区分群体分子遗传标记位点。洞庭湖群体未发现特异位点。在5个群体间鄱阳湖群体多态性位点、核苷酸多态性、单倍型多态性和单倍型数量4个指标都最高,表明鄱阳湖群体具有最为丰富的遗传结构,遗传变异最大,可作为三角帆蚌选育的基础群体。     

三角帆蚌金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RACE技术,获得了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)金属硫蛋白基因的全长cDNA序列.该序列全长467 bp,由长92 bp的5'UTR(untranslated region),159 bp的3'UTR,和216 bp的开放阅读框(openreading frame,ORF)组成.共编码71个氨基酸,分子量大约为7.1 ku,理论等电点为7.24.该蛋白序列中半胱氨酸含量最丰富(29.6%),其次是甘氨酸(14.1%),存在软体动物金属硫蛋白的特征序列CKCXXXCXCX,且C-末端的氨基酸序列也符合软体动物金属硫蛋白标签序列C-X-C-X(3)-C-T-G-X(3)-C-X-C-X(3)-C-X-C-K.蛋白序列特征分析表明,该序列与其他贝类的金属硫蛋白基因具有很高的相似性,具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族的成员.     

三角帆蚌GPX基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析

根据本实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列, 利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPX)基因cDNA全序列。序列分析表明, 该基因cDNA序列全长1286 bp, 包括5′端非翻译区(Untranslated Region) 39 bp、3′端非翻译区659 bp和开放阅读框(Open reading frame, ORF)588bp, 共编码195个氨基酸, 分子量约为22.2 kDa, 理论等电点为8.44, 属于含硒类GPX。该氨基酸序列具有GPX所有亚型中均高度保守的3个环状结构, 对酶的三级结构起稳定作用。在线分析结果表明: GPX的氨基酸序列不存在明显的疏水区, 也不存在信号肽序列。氨基酸相似性对比结果显示, 三角帆蚌GPX氨基酸序列与脊椎动物GPX-2及GPX-1的序列相似度较高, 为73.1%-80.8%, 与其他型GPX相似度较小, 相似度低于60%。构建的系统进化树显示三角帆蚌GPX与其他几种鱼类GPX聚为一类, 与其他已发表的几种软体动物GPX相距较远, 推测本实验克隆的三角帆蚌GPX基因和已发表的软体动物不属于同一种GPX类型。     

鄱阳湖日本沼虾15个群体遗传多样性的微卫星分析

利用徽卫星分子标记研究鄱阳湖15个日本沼虾(Macrobrachium nipponense野生群体的遗传多样性.结果表明:10个微卫星位点呈高度多态性,共检测到129个多态性位点;每个群体中至少有5个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡,表现出杂合不足;15个日本沼虾群体均表现出较高的遗传多样性,其中大坝外群体和星池群体遗传多样性较高,万户和湖口群体相对较低.瓶颈效应和突变-漂移平衡分析表明,鄱阳湖日本沼虾群体近期没有经历过瓶颈效应,群体数量也没有下降.群体间F统计量及AMOVA分析显示,鄱阳湖日本沼虾群体存在极显著的遗传分化程度(FST=0.04709,P＜O.01).综上所述,鄱阳湖日本沼虾群体具有丰富的遗传多样性,可作为日本沼虾选育的基础群.