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目的:对Anoxybacillussp.DL3的产蛋白酶条件及其酶学性质进行研究,为下一步进行蛋白酶基因的克隆、表达提供依据。方法:应用常规方法液体培养细菌,研究温度、pH、培养基中碳源、氮源对菌株产蛋白酶的影响,硫酸铵盐析的方法提取酶液,并采用Folin法测酶活性。用紫外分光光度计在OD680hi/1测吸光值。并对提取的蛋白酶液进行酶的最适温度、pH以及酶的热稳定性和pH稳定性研究,向酶液中添加金属离子和EDTA、PMSF,研究其对酶活性的影响。结果:在培养基初始pH是6.5,培养温度为40℃时菌株产酶酶活性最大;培养基中以乳糖为碳源,酵母膏和硫酸铵为氮源,碳源与氮源的比例为1:2时,酶活最大。酶学性质研究结果显示:该酶的最适反应温度是55℃,最适反应pH是7.0;在50℃保温20min-80min内,酶活力下降幅度较小。60℃保温60min后,仍保持约60%的酶活。70℃保温60min后,残余酶活为30%。该酶在pH为6.0~8.0范围内,相对酶活差别不是很大,下降趋势大致相同。在强碱条件下,相对酶活下降很明显。Fe2+、Cu2+和Hg2+对酶活性有明显的抑制作用;Ca2+、Mg^2+、Mn2+等金属离子对酶活性有明显的促进作用;乙二胺四乙酸(EDTA)和苯甲基磺酰氟(PMSF)对酶活性也有一定抑制作用。结论:Anoxybacillussp.DL3所产的蛋白酶为嗜热中性蛋白酶,此酶具有较好的热稳定性和pH耐受性,该菌株具有进一步开发、利用的价值。 相似文献
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目的 建立重组定点突变巴曲酶的质控方法和质量标准.方法 生物学活性测定采用血浆凝集活性测定法;通过胰蛋白酶消化和RP-HPLC法分析该蛋白还原型肽图;其余检测项目均按<中华人民共和国药典>2010年版(三部)相关规定进行.结果 用建立的方法对三批重组定点突变巴曲酶原液和成品进行检定,各项指标均符合2010版<中华人民共和国药典>和相应指导原则的要求.三批原液比活性均≥2000 kU/mg.肽图三批次之间一致,原液的蛋白含量、纯度、分子质量、等电点、N末端氨基酸序列等指标均符合规定.结论 建立的质控方法可有效地控制重组定点突变巴曲酶产品质量,并可用于定点突变巴曲酶原液及成品的常规检定. 相似文献
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将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅢ基因亚克隆到表达载体pET-22b(+),构建重组质粒pET-egl3,转化到大肠杆菌BL21(DE3)。利用金属亲和层析对重组EGⅢ进行纯化,纯化后酶比活力达到6u/mg蛋白,最适反应温度为60℃,最适pH为4.0。同时对EGⅢ催化区的氨基酸残基R130和E218进行定点饱和突变,各筛选到一株酶活有提高的突变子R130P和E218F,其比活力为野生型EGⅢ的2.8倍和3.45倍。突变酶E218F的Km提高了一倍,催化效率Kcat提高了5.4倍;而R130P的Km和Kcat没有明显变化。两个突变酶的最适酶解温度和pH分别都提高至65℃和4.4。 相似文献
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目的 为避免毕赤酵母分泌的Kex2蛋白酶对发酵液中所表达的巴曲酶的降解.利用重叠PCR方法对巴曲酶基因进行定点突变,将巴曲酶基因第45位的Arg突变为Lys.方法 将突变后的基因克隆到酵母分泌型表达载体pPICZαA中,将重组载体酶切线性化后经电转化转入巴斯德毕赤酵母细胞,筛选鉴定转化子,经摇瓶发酵甲醇诱导,酵母菌分泌表达有凝血活性的定点突变巴曲酶,经SDS-PAG电泳、免疫印迹确定其分子量为32 kD.结果发酵罐的表达量达到52 KU/ml发酵液,较重组天然巴曲酶的表达量提高了73.3%.结论 定点突变巴曲酶的表达量比重组天然巴曲酶的表达量有显著提高,表达的突变巴曲酶同样具有凝血活性. 相似文献
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一株产木聚糖酶的黑曲霉固态发酵产酶性质的研究 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:选育产木聚糖酶活力高的黑曲霉菌株,对其产酶条件进行优化,并研究其酶学性质。方法:通过木聚糖酶解木聚糖产生透明圈的方法,筛选产木聚糖酶菌株,测定固体发酵培养基中玉米芯与麸皮的比例、培养温度、培养时间、添加氮源对产酶的影响。进行了作用温度、pH值、金属离子对酶活力的影响试验,以及酶不同温度下的热稳定性的试验。结果:从自然界筛选得到一株产木聚糖酶的黑曲霉菌株,通过对固态发酵培养条件优化,最终产酶水平达到了5500u/g固体干曲。酶的最适作用温度是45℃、最适作用pH值4.8,是一种偏酸性酶。该酶在45℃以上的温度保存会使酶活力迅速丧失,Mg^2+、Zn^2+对该酶有激活作用,而Mn^2+、Cu^2+、Hg^2+则完全抑制酶的活性。结论:选育的黑曲霉菌株产木聚糖酶活力较高,培养条件简单。 相似文献
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目的对毕赤酵母表达的textlinin-1(Q8008)进行分离纯化,并对其抑制plasmin活性的性质进行研究。方法构建表达Q8008pachia pastoris工程菌,经发酵、纯化得到纯度达95%以上的Q8008。考察不同的温度、pH缓冲液和金属离子等条件对Q8008抑制plasmin活性的影响。结果 Q8008在中性条件下比较稳定,其最适pH值为7.0,最适温度为40℃,在30~50℃相对酶活力在90.0%以上;有2个金属离子对Q8008活性测定方法的影响产生了显著性差异,Zn2+起激活作用,Co2+起抑制作用,其余金属离子均无显著性差异。结论 Q8008在中性pH下抑制活性稳定;在50℃以下,受温度变化影响较小;金属离子对其抑制活性测定有一定影响。 相似文献
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用硫酸铵分段盐析、超滤膜分级分离及DEAE-纤维素、Sephadex A-25和Sephadex G-50三种柱层析方法从双胸蚓组织的粗提取液中分离纯化出一种纤溶酶,分子量为29kD,由一条肽链组成。此晦具有强烈的溶解纤维蛋白的作用,对家兎实验性血凝块也具有明显的溶解作用。此酶的最适pH为8.0,在pH7.6~8.4之间活力相差不到2%;酶在PH4.7—11.0范围内稳定;酶作用的最适温度为57℃;此酶热稳定性较好,于25~50℃保温3小时,酶活力基本不变,60℃时,活力保留65%。金属离子Na~(+)、K~(+)、Mg~(2+)等可提高此酶的活力,而Hg~(2+)、Ca~(2+)等金属离子对此酶有不同程度的抑制作用。 相似文献
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目的:观察脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶(GAL)在不同pH缓冲液、不同温度下的稳定性,以及不同离子及还原剂对酶活性的影响。方法:以GAL对单糖底物对硝基-苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)的活性为主要检测指标,观察不同离子及还原剂等对酶活性的影响;观察GAL在不同pH缓冲液中和不同温度下的稳定性。结果:钙离子、锌离子、钴离子和高浓度的锰离子增强酶的活性,DTT抑制酶的活性,螯合剂EDTA的加入提高了酶活性。GAL在pH4.6~7.5时保存1 h后稳定性很好,能保持最高活性的90%以上;在4℃~45℃下保存的稳定性最好,45℃开始活性下降。结论:GAL具有很好的温度稳定性和pH稳定性,使其适用于血型转变和异种移植。 相似文献
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由腐植土中分离到一株嗜热真菌,经鉴定为特异腐质霉(Humicola insolens Cooney etEmerson)。研究了这株菌纤维素酶的产生条件和一般性质。菌在含麦麸5%、NaNO0.3%的液体培养基(灭菌前pH7.5,灭菌后pH7.2)中,于45℃培养4天,以羧甲基纤维素钠为底物,每ml滤液酶活力为20个单位。酶作用的最适条件为:pH6.0,温度为65—70℃。该纤维素酶是一种耐热酶,热稳定性较强,70℃保温5分钟后,酶活力剩余88%。底物对该酶的热钝化有较强的保护作用,无底物存在条件下,70℃保温6小时后,酶活力仅剩余1%,而在同样的处理温度和时间,在有底物存在条件下,酶活力可剩余30%。该酶在45℃保温15小时的条件下,pH稳定范围为6.0—9.0。 相似文献
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产低温脂肪酶菌株Geotrichum candidum ch-3的选育、发酵条件及酶学性质研究 总被引:3,自引:0,他引:3
从新疆昌吉市油脂化工厂的含油冻土中筛选到一株产低温脂肪酶的菌株ch-3,形态鉴定及18SrDNA序列分析表明该菌株为白地霉,命名为Geotrichum candidum ch-3。我们对其生长及产酶情况和酶性质做了初步研究。该菌株的最适生长温度是20℃。玉米浆、豆油可显著促进脂肪酶的产生。粗酶液经双水相萃取和Sephadex G-75凝胶过滤分离纯化后进行酶学性质的研究。该脂肪酶最适作用温度为35℃,在0℃可保持66%的相对酶活性,最适pH值为7.0,对热较敏感,50℃处理20min,剩余酶活为55%,Fe2+、Cu2+、Mn2+以及Ca2+对酶有较强的激活作用。 相似文献
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从产L-丝氨酸菌株假单胞菌N-13中纯化了丝氨酸羟甲基转移酶,并对其性质进行了研究.结果表明,丝氨酸羟甲基转移酶酶活力在pH=7.0~9.0间稳定,最适宜pH=8.0;酶的最适温度为35℃,在30~40℃水浴30 min酶活力未见明显下降.磷酸吡哆醛的最适添加浓度为25 μmol·L-1.研究了不同金属离子对酶活力的影... 相似文献
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游离及固定化果糖基转移酶部分酶学性质的比较研究 总被引:4,自引:0,他引:4
从诱变、筛选的米曲霉GX0 0 10菌株所产生的果糖基转移酶 ,经过纯化和固定化操作分别制备游离酶和固定化酶 ,对两者的酶学性质进行了比较研究 .结果表明 ,两者在蔗糖转化为蔗果低聚糖的酶促反应中 ,最适pH为 5 5,在pH5 0~ 7 5之间酶活性相对稳定 .游离酶和固定化酶的适宜温度范围分别是 4 5~ 52℃和 4 0~ 55℃ .在 55℃保温 60min ,酶活性保存率分别是 61 6%和 87 5% .固定化酶的热稳定性提高 .0 1mmol LHg2 +和 1mmol LAg+能完全抑制游离酶的活性 ,但只能部分抑制固定化酶的活性 ,1mmol L的Ti2 +能完全抑制两者的活性 .以蔗糖为底物时 ,游离酶的米氏常数Km=2 15mmol L ,而固定化酶Km =386mmol L .游离酶只能使用一次 ,固定化酶反复使用 54次后 ,剩余活力为 55 2 % .用 55% (W V)蔗糖溶液与固定化酶在pH5 0 ,4 6℃下作用 12h ,可获得61 5% (总低聚糖 总糖 )产物 ,其中蔗果五糖含量达到 7 2 % . 相似文献
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从大量霉菌中选育到一株具有较高富马酸酶活性的温特曲霉(Aspergillus wentii) A5-61。在摇瓶培养条件下,32℃ 96小时,产L-苹果酸达10.49g/100ml,对富马酸的转化率达90.80%。利用菌体细胞,进行酶转化试验,结果表明:1.6g湿菌体接入25ml含富马酸10.0%(用NaOH中和至pH7.0)的转化液中,35℃16~24小时,连续转化三次,分别产生L—苹果酸9.61g/100ml、9.73g/100ml、6.93g/100ml。对菌体整体细胞酶学性质的研究表明,其最适反应温度35℃,最适反应pH7.0,Cu2+对该酶有明显的抑制作用,该酶的Km=0.154mol/L,Vmax=0.0571mol/L·h。 相似文献