抑制ATR基因可提高HeLa细胞对烷化剂的敏感性

目的：探讨ATR基因的表达对HeLa细胞对烷化剂敏感性的影响。方法：采用RNA干扰技术抑制HeLa细胞ATR基因的表达,观察ATR被阻断后HeLa细胞对烷化剂敏感性的变化,从而确定ATR基因的作用。结果：筛选到表达针对ATR基因的短发夹RNA（shRNA）阳性克隆,Western印迹结果显示ATR基因表达受到明显抑制;HeLa细胞对烷化剂的敏感性实验提示,ATR shRNA^＋HeLa细胞对烷化剂的敏感性明显增强。结论：抑制ATR基因可明显提高HeLa细胞对烷化剂的敏感性。     

脑胶质瘤MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化状态研究

目的：探讨脑胶质瘤患者O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因MGMT和错配修复基因hMLH1、hMSH2启动子CpG岛甲基化状态,及其在烷化剂化疗中的意义。方法：采用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测39例脑胶质瘤和6例正常脑组织MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区的甲基化状态,免疫组化方法测定蛋白表达。结果：脑胶质瘤患者组织MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化发生率分别为46.2%、10.3%和20.5%,3种基因启动子未甲基化模式与其对应蛋白表达模式相似,并与患者性别、年龄、病理类型和病理分级无明显相关性。回顾性分析患者资料,显示39例脑胶质瘤患者中,MGMT基因甲基化的患者生存期显著高于MGMT基因未甲基化患者（P〈0.05,Log-rank检验）。结论：MGMT及错配修复基因甲基化是脑胶质瘤发生过程中常见的分子事件,可能与肿瘤的发生有关;检测MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化状态,在判断脑胶质瘤患者预后和预测烷化剂化疗耐药性中可能具有重要意义。     

大肠杆菌菌蜕装载质粒DNA实验方法的优化

目的:优化大肠杆菌菌蜕装载质粒的效率,并将装载质粒的菌蜕转染抗原提呈细胞,以提高核酸疫苗的递送水平。方法:将质粒pHH43转化大肠杆菌DH5α,制备大肠杆菌菌蜕;优化菌蜕装载质粒时菌蜕、质粒和膜囊的比例,获得更高的装载效率,通过扫描及透射电镜、流式细胞术观察其形态变化及装载效率;将装载质粒的菌蜕与抗原提呈细胞——巨噬细胞RAW264.7和树突状细胞DC2.4共孵育,观察吞噬效果。结果:优化了大肠杆菌菌蜕装载质粒的效率,当菌蜕、质粒、膜囊的比例为7∶10∶4时效率达到最佳,装载DNA效率达98%以上;抗原提呈细胞吞噬装载了质粒的菌蜕,效率达100%。结论:大肠杆菌菌蜕可高效装载核酸疫苗,且高效被抗原提呈细胞捕获,有助于提高核酸疫苗的递送和免疫效果的提高。     

人α-半乳糖苷酶、α-1,2-岩藻糖转移酶cDNA序列转染克服异种移植超急性排斥反应

半乳糖α 1,3 半乳糖抗原是引起异种器官移植超急性排斥反应 (hyperacuterejection ,HAR)的主要抗原 .α 半乳糖苷酶和α 1,2 岩藻糖转移酶基因可以以不同的方式降低半乳糖α 1,3 半乳糖抗原在内皮细胞表面的表达量 .将人α 半乳糖苷酶基因和α 1,2 岩藻糖转移酶基因单独或连接在一起导入猪血管内皮细胞PEDSV .15中 ,检测细胞表面的抗原及异种天然抗体对细胞杀伤作用 .结果表明α 半乳糖苷酶基因可以将猪血管内皮细胞表面的半乳糖α 1,3 半乳糖抗原清除 74 13%,而α 1,2 岩藻糖转移酶基因也可以清除 4 7 75 %的细胞表面异种抗原 ,但二者都不能达到完全清除的目的 .当α 半乳糖苷酶和α 1,2 岩藻糖转移酶双基因在内皮细胞内共表达时 ,则可以基本清除半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 .抗原的减少也可以相应地减弱内皮细胞对异种天然抗体介导的杀伤作用的敏感性 ,尤其是双基因共表达时细胞基本不被杀伤 .结果表明 ,α 半乳糖苷酶基因和α 1,2 岩藻糖转移酶基因可以有效地清除血管内皮细胞表面的半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 ,克服HAR的发生 ,为下一步进行动物实验 ,探讨克服异种移植HAR提供了技术途径     

抗谷胱甘肽S转移酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的:制备谷胱甘肽S转移酶(GST)的兔多抗,并鉴定该抗体的特异性。方法:用纯化的GST标签蛋白(纯度>98%)免疫新西兰大白兔,获得GST的兔抗血清,并经HiTrap rProtein A柱纯化获得高效价高特异性的抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,Western印迹检测抗体的特异性,并与商业化抗体进行对比。结果:通过免疫法得到了GST的兔多克隆抗体血清,抗体效价达1∶1×106,经rProtein A柱纯化后获得了高效价高特异性的抗体,其高效高特异性已达商业化抗体水平。结论:获得了GST的高效价高特异性的兔多克隆抗体。     

B→O血型转变工具酶α-半乳糖苷酶cDNA克隆及表达

 α-半乳糖苷酶是实现 B→O血型转变、制备通用型血的关键工具酶 .利用反转录 PCR方法从中国海南 Catimor咖啡豆中克隆α-半乳糖苷酶 c DNA,插入嗜甲基酵母 P.pastoris分泌表达载体 p PIC9K中 ,转化 P.pastoris GS1 1 5,筛选高表达重组菌株 .经甲醇诱导表达 7d后 ,发酵液总蛋白分泌量约 1 .2 mg/ml,SDS- PAGE呈现约 41 k D特异表达带 ,与专一性底物对 -硝基 -苯基 -α- D-吡喃半乳糖苷反应证明 ,表达产物具有 α-半乳糖苷酶活性 ,最高达到 1 8U/ml.初步实验表明 ,表达的 α-半乳糖苷酶可酶解 B型红细胞 ,成功实现 B→O血型转变 .     

一种可降解的阳离子聚合物基因转染试剂

目的：合成一种高效、低毒的新型阳离子聚合物载体。方法：以低分子量的聚乙烯亚胺（PEI）为阳离子聚合物的基本单位,以可水解的2,4-戊二醇二丙烯酸盐（PODOA）为交联剂,合成高分子聚合物。用DNA凝胶迟滞实验验证聚合物与DNA的亲和力,以绿色荧光蛋白基因和萤光素酶检测其基因转染效率,用聚合物凝胶电泳实验鉴定其降解性,以MTT法检测其细胞毒性。结果：聚合物具有高的DNA结合亲和力、高基因转染效率,基因转染后的萤光素酶活性高达3×10^9RLU／mg,其基因转染效率相当于甚至优于目前市售的转染试剂,而细胞毒性明显低于其他试剂。该聚合物在中性环境下可降解,而在酸性条件下非常稳定。结论：合成的聚合物具有高转染效率和低细胞毒性,可能在转染和基因治疗研究中起重要作用。     

猪α-1,3-半乳糖转移酶基因打靶载体的构建

目的:构建猪α-1,3-半乳糖转移酶(GGTA1)基因的正负筛选打靶载体。方法:以原代猪胚胎成纤维细胞基因组DNA为模板,采用长程PCR方法扩增出GGTA1基因的2条片段;以长约2kb包含部分第9外显子的片段为同源短臂,在XbaⅠ和ClaⅠ位点插入pLoxP质粒正筛选标记neo基因的3'端;以长约5.4kb包括部分第8外显子、全部第8内含子及部分第9外显子的片段为同源长臂,于NotⅠ位点插入该质粒中neo基因的5'端;2.7kb的负筛选标记tk基因位于载体中同源短臂的3'端外侧。结果与结论:酶切、PCR及测序结果表明,同源臂被正确连接至质粒pLoxP,成功构建了猪GGTA1基因正负筛选打靶载体pSL/GT。     

新型α-半乳糖苷酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的：制备高效价、高特异性的新型α-半乳糖苷酶的兔多抗,并鉴定该抗体的特异性。方法：用脆弱类杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶（纯度大于90％）免疫新西兰大白兔,获得α-半乳糖苷酶的兔抗血清,并经HiTrap rProteinA柱纯化获得高纯度的抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,Western印迹评价抗体的特异性。结果：通过免疫法得到了α-半乳糖苷酶的兔多克隆抗体血清,抗体效价达1：1×10^6,经rProteinA柱纯化后获得了高效价、高纯度的抗体,Western印迹显示该抗体特异性地与新型α-半乳糖苷酶结合。结论：获得了新型α-半乳糖苷酶的高效价、高特异性的兔多克隆抗体,可用于血型转变过程中残留α-半乳糖苷酶含量的特异性检测。     

酶解转变的人红细胞输注大鼠的实验研究

目的：利用大鼠评价酶解转变的人红细胞的安全性。方法：人红细胞与大鼠血清进行常规配血,检测二者之间的相容性;将人B型红细胞酶解后输注大鼠,流式细胞术检测人红细胞在大鼠体内的存活率。结果：人红细胞与大鼠血清不凝集,但人红细胞输注大鼠体内很快被排斥,1h下降至50％以下,18h被完全排斥。结论：仅依靠红细胞配血实验来选择人红细胞输血动物模型是不全面的,大鼠不适合作为酶解转变的人红细胞安全性评价的动物模型。