白蚁内切-β—1，4-葡聚糖酶基因的克隆、表达、纯化及酶学性质的研究

提取了台湾家白蚁总RNA并反转录获得eDNA,PCR扩增出白蚁内切葡聚糖酶的基因,并将目的基因分别克隆到大肠杆菌和酿酒酵母载体中,构建了产内切-β-1,4-葡聚糖酶的基因工程菌。由于大肠杆菌会有少量的泄漏表达,而所用的酿酒酵母表达载体是本实验室构建带有INU信号肽的表达载体,故都可采用刚果红平板染色法筛选具有羧甲基纤维素酶（CMCase）活性的重组转化子。利用金属镍亲和层析对大肠杆菌表达的内切-β-1,4-葡聚糖酶进行纯化,CMC酶活检测显示纯化酶的最适温度和最适pH值分别为42℃、6．5;内切-β-1,4-葡聚糖酶的Vmax为0．071mg／mL·min,Km值为80．2712mg／mL。     

绿色木霉葡聚糖内切酶EGIII基因在大肠肝菌中的表达、定点突变及其动力学特性的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGIII基因亚克隆到表达载体pET-22b(+),构建重组质粒pET-egl3,转化到大肠杆菌BL21(DE3).利用金属亲和层析对重组EGIII进行纯化,纯化后酶比活力达到6 U/mg蛋白,最适反应温度为60 ℃,最适pH为4.0.同时对EGIII催化区的氨基酸残基R130和E218进行定点饱和突变,各筛选到一株酶活有提高的突变子R130P和E218F,其比活力为野生型EGIII的2.8倍和3.45倍.突变酶E218F的Km提高了一倍,催化效率Kcat提高了5.4倍;而R130P的Km和Kcat没有明显变化.两个突变酶的最适酶解温度和pH分别都提高至65 ℃和4.4.     

代谢工程改造多粘芽孢杆菌及合成光学纯(R,R)-2,3-丁二醇

(R,R)-2,3-BD是一种重要的四碳平台化合物,在液晶材料、高附加值手性化合物,尤其是不对称合成光学纯药物等方面有天然优势.将来源于多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DSM 365的α-乙酰乳酸合成酶(α-acetolactate synthase)基因 alsS、α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase)基因alsD和(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶(2,3-butanediol dehydrogenase)基因R,R-bdh与表达载体pMA5连接,导入多粘芽孢杆菌P.polymyxa DSM 365中加强(R,R)-2,3-丁二醇的主代谢途径,构建可高效合成(R,R)-2,3-丁二醇的多粘芽孢杆菌工程菌株DM-5.利用工程菌株DM-5补料分批发酵60 h,(R,R)-2,3-丁二醇产量达54.91 g/L,得率为0.52 g/g,生产强度为0.92 g·L-1·h-1,与野生菌株相比(R,R)-2,3-丁二醇产量增加19.66％,且副产物甲醇浓度不变,乙醇、乙偶姻积累下降.本研究结果表明,在多粘芽孢杆菌中过量表达关键基因alsS、alsD和R,R-bdh 能够显著提高(R,R)-2,3-丁二醇的产量和生产强度,为多粘芽孢杆菌的代谢工程改造和工业化生产(R,R)-2,3-丁二醇提供参考.     

高产光学纯(R,R)-2,3-丁二醇工程菌株构建与发酵优化

[目的]构建能够专一性合成光学纯(R,R)-2,3-丁二醇的大肠杆菌工程菌,并进行发酵条件优化。[方法]将来源于多粘芽孢杆菌的(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh,来源于阴沟肠杆菌的α-乙酰乳酸合成酶基因bud B和α-乙酰乳酸脱羧酶基因bud A与表达载体p Tr C99A连接,导入大肠杆菌中构建人工合成途径。筛选最适的培养基和发酵条件,提高(R,R)-2,3-丁二醇的产量、产率和得率。[结果]获得高效合成(R,R)-2,3-丁二醇的工程菌株GXASB,筛选到最适碳源及其浓度为120 g/L木薯淀粉,最适pH为6.5,最适接种量为10%,在发酵罐中进行同步糖化法发酵,(R,R)-2,3-丁二醇产量达到105.28 g/L,光学纯为99.1%,得率为0.47 g/g,生产强度为1.95 g/(L·h)。[结论]在大肠杆菌中表达基因簇bud B-bud A-bdh能够专一性合成光学纯(R,R)-2,3-丁二醇,经优化发酵条件后,能够显著提高(R,R)-2,3-丁二醇的合成效率。同时工程菌能够利用非粮原料木薯淀粉高效生产(R,R)-2,3-丁二醇,补料发酵产量达到105.28 g/L,为使用廉价原料工业化生产(R,R)-2,3-丁二醇提供参考。     

四环素抗性重组鼠李糖乳杆菌的构建

将含有鼠李糖乳杆菌同源序列的自杀质粒pUC-ldhD-Ter转化到鼠李糖乳杆菌JCM 1553中,成功获得2株含四环素抗性的重组鼠李糖乳杆菌GL-1和GL-2。采用PCR技术鉴定重组菌株染色体基因组上含有四环素抗性基因Ter;生长曲线说明四环素抗性基因的插入对鼠李糖乳杆菌的生长没有较大影响。抗性菌株GL-1和GL-2在含10%葡萄糖的摇瓶发酵培养基发酵结果显示:37℃,200 r/min发酵40h,菌体密度OD₆₀₀最大达到25.49和24.66,残糖含量为0.60%和0.63%,L-乳酸最高产量为93.956 g/L、93.693 g/L,葡萄糖转化率达到94.82%、94.56%,与原始菌株没有显著区别。     

应用合成生物学策略构建全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻

目的:在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶(DAR),同时构建辅酶NADH原位再生系统,利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成(S)-乙偶姻。方法:PCR克隆多黏芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) dar基因连到质粒pETDuet-1,转化至大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR;通过Hi Trap TALON柱亲和层析纯化表达产物DAR酶蛋白,测定DAR的比酶活和分子动力学参数。在重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR中构建辅酶NADH原位再生系统,协同表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(GDH),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH,并以此重组菌为全细胞生物催化剂,优化催化条件,提高(S)-乙偶姻的产量和产率。结果:获得重组工程菌E. coli BL21(DE3)-DAR和E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH。DAR以NADH为辅酶还原丁二酮的米氏常数Km、最大催化速率Vmax、催化常数Kcat分别为2. 59mmol/L、1. 64μmol/(L·min·mg)、12. 3/s,还原丁二酮生成(S)-乙偶姻光学的纯度为95. 86%,具有较好的催化效率和立体异构体选择性。构建辅酶NADH原位再生系统后,重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH可高效催化丁二酮合成乙偶姻。在最优催化条件下分批补料,乙偶姻产量达51. 26g/L,转化率为81. 37%,生产速率为5. 13g/(L·h)。结论:使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物(S)-乙偶姻,以重组菌为全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻,不需额外添加昂贵的辅酶,具有较高的生产应用价值。     

马里亚纳海沟共培养细菌多样性动态变化及潜在微生物互作关系

马里亚纳海沟是世界已知最深的海沟,其寡营养、高压、低温、低氧等极端的深海环境孕育出独特的细菌群落结构及多样性特征。选取寡营养培养基对马里亚纳海沟海水及表层沉积物分别进行液体共培养,并在不同培养阶段取样进行高通量测序,分析细菌群落结构组成及其多样性的动态变化,探讨微生物之间可能的互作关系。研究结果表明：液体共培养样品中一共检测到19个门、34个纲、76个目、131个科、227个属的细菌,其中变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为优势菌群,其次为厚壁菌门（Firmicutes）;与其他样品相比,1000米海水样品中细菌群落的多样性最高,并且蓝细菌门（Cyanobacteria）具有更高的相对丰度。共培养样品中细菌丰富度、多样性、群落结构均随培养时间而改变,其中共培养中期样品的细菌多样性较高;表层沉积物样本中,盐单胞菌属（Halomonas）可能由于较强的竞争能力在共培养后期占据优势地位。基因功能预测与代谢通路富集结果显示,随着共培养时间的增加,微生物生长相关的代谢通路丰度明显下降,而与互作相关的代谢通路丰度明显增加。共培养样品检测到的细菌多样性远高于单独分离培养的多样性,仅有少量菌属为单独分离培养与共培养样品均检测到的共有属。综上所述,马里亚纳海沟细菌群落中存在竞争、互利共生的相互作用,共培养法有利于揭示细菌间的互作关系。研究为深渊及深海等极端环境下微生物生态系统组成及维持奠定了理论基础,也为进一步研究极端微生物的生存策略提供了科学指导。     

绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅢ基因在大肠杆菌中的表达、定点突变及其动力学特性的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅢ基因亚克隆到表达载体pET-22b（＋）,构建重组质粒pET-egl3,转化到大肠杆菌BL21（DE3）。利用金属亲和层析对重组EGⅢ进行纯化,纯化后酶比活力达到6u／mg蛋白,最适反应温度为60℃,最适pH为4．0。同时对EGⅢ催化区的氨基酸残基R130和E218进行定点饱和突变,各筛选到一株酶活有提高的突变子R130P和E218F,其比活力为野生型EGⅢ的2．8倍和3．45倍。突变酶E218F的Km提高了一倍,催化效率Kcat提高了5．4倍;而R130P的Km和Kcat没有明显变化。两个突变酶的最适酶解温度和pH分别都提高至65℃和4．4。     

鼠李糖乳杆菌D-(+)-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR的方法从鼠李糖乳杆菌基因组DNA中扩增到D-(+)-乳酸脱氢酶基因(ldhD),并连接到载体pSE380上,构建表达质粒pSE-ldhD,将重组质粒pSE-ldhD转化大肠杆菌BL21(DE3),重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明ldhD在大肠杆菌中实现了表达,表达产物的分子量约为37kD。同时采用紫外分光光度法测定D-乳酸脱氢酶的酶活,测得重组菌株的D-乳酸脱氢酶活力为5.4U/mL,最适反应温度为35℃,最适pH为5.6。