肾型IBVS1基因重组BCG菌株的构建及其免疫原性研究

S1基因是传染性支气管炎病毒(IBV)的主要保护性抗原基因,应用RT-PCR技术特异地扩增嗜肾型传染性支气管炎病毒X株的S1基因,经序列分析证实为S1基因,将其连接到含有人结核分枝杆菌启动子hsp70基因和堪萨斯分枝杆菌α信号肽基因的表达载体pRR3上,从而构建了大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pR-α-S1,再电转化至BCG中,形成重组菌株rBCG-S1。热激后S1蛋白在耻垢分枝杆菌M.smegmatismc2155中高效表达,并且通过ELISA和Western blot检测能够被抗IBVS1蛋白的单克隆抗体识别。将106CFU的重组菌株rBCG-S1皮下注射免疫6周龄的SPF鸡,动物保护试验结果表明重组菌株rBCG-S1对鸡具有一定的免疫保护效果,能够保护SPF鸡抵抗IBVX毒株强毒攻击。血凝抑制试验表明血凝抑制抗体滴度能够显著增加。构建的重组菌株为今后开发新型鸡传染性支气管炎基因工程弱毒疫苗奠定了基础。     

鸡Vezf1基因RCAS干扰载体构建及鉴定

为研究Vezf1基因在鸡胚早期发育过程中的作用,构建了针对鸡Vezf1基因的RCAS病毒RNA干扰载体,分别在鸡胚细胞和胚胎水平对Vezf1基因实施沉默,通过Real-time PCR和原位杂交法检测目的基因m RNA表达水平。结果表明,基于RCAS病毒的干扰载体可以在鸡胚成纤维细胞和活体鸡胚中成功沉默Vezf1基因的表达。此研究为利用鸡胚模型深入了解Vezf1基因在早期发育过程中的作用提供了素材。     

以木糖异构酶基因xylA为选择标记的Gateway系统植物表达载体的构建

目的:构建以木糖异构酶基因xylA为筛选标记的无抗生素标记Gateway系统植物表达载体。方法:克隆大肠杆菌木糖异构酶基因xylA并用其替换植物表达载体pCAMBIA1301中的hpt基因,利用载体中的多克隆位点将Gateway Binary Vector(pH7WG2D)中酶切位点XbaⅠ和HindⅢ之间包括P35S、T35S、attR1、attR2和CmR-ccdB的片段重组入表达载体pCAMBIA1301中,构建表达载体pCAMBIA1301-xylA-GW,利用含有津田芜菁HY5基因片段的BP反应产物与载体进行LR反应,获得含有目的基因的植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-HY5,并导入根癌农杆菌LBA4404中。结果:抗生素筛选及酶切和PCR鉴定表明成功构建了以xylA为筛选标记的无抗生素标记植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-HY5。结论:利用木糖异构酶基因xylA结合Gateway克隆技术构建无抗生素标记植物表达载体,可简化、方便植物转基因表达载体构建。     

禽流感病毒H5N1亚型NS1基因在大肠杆菌中的表达

目的表达H5N1亚型禽流感病毒(AIV)NS1蛋白,用于AIV感染与注射灭活疫苗鸡的鉴别诊断和NS1蛋白功能研究。方法采用RT_PCR方法对H5N1亚型AIVNS1基因进行扩增,将PCR产物克隆于pGEM_T_easy载体,将该基因插入pGEX_4T_1中构建NS1基因原核表达载体,转化BL21大肠杆菌后,在IPTG诱导下表达NS1蛋白,Westernblot鉴定表达NS1蛋白。结果成功克隆H5N1亚型AIV的NS1基因,其核苷酸序列长度为690bp,编码230个氨基酸残基。构建NS1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约51×103的NS1融合蛋白。Westernblot鉴定表明表达NS1蛋白与H7N2AIV感染鸡血清有反应性。结论在大肠杆菌中成功表达了H5N1亚型AIVNS1基因蛋白,具有与感染H7N2亚型AIV阳性血清反应原性。     

利用病毒载体在烟草中瞬时表达融合HBsAg基因

利用马铃薯PVX病毒载体构建了外源人工融合乙肝表面抗原HBsAg基因的表达载体,在烟草中利用农杆菌介导进行瞬时表达,以快速鉴定外源基因瞬时表达的状况以及重组蛋白的免疫活性。利用PCR技术从含有人工融合HBsAg基因的表达载体中分别扩增出LP PreS1 PreS2 S、PreS1 PreS2 S、PreS2 S序列,将其分别与PVX病毒载体pgR106连接,构建成PVX-LP、PVX-S1和PVX-S2等3个转化载体,并将此载体导入农杆菌菌株GV3101中用于侵染烟草植株叶片。感染植株经RT-PCR、RNA Dot blotting和HBsAg蛋白的ELISA检测显示,3个人工融合的HBsAg基因均可在植物体内得到转录,翻译成具有活性的蛋白。结果表明,外源融合HB-sAg基因经过植物病毒载体瞬时表达系统可以在植物系统中正常转录和翻译。     

鸡传染性支气管炎病毒H株纤突蛋白S1基因的克隆及其在毕赤酵母中表达

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)河南分离株H,经SPF鸡胚增殖,差速离心纯化病毒,SDS-蛋白酶K法抽提病毒RNA。参照IBV Bcaudette株纤突蛋白S1基因序列设计并合成引物,以其进行RT—PCR,成功地扩增出IBV H株S1基因。扩增产物经Bst YⅠ Hae Ⅲ和Pst Ⅰ酶切分析,结果表明,IBV H株S1基因的RFLP图谱与M41株S1基因的完全一致,初步断定IBV H株为Mass血清型。将IBVH株S1基因克隆于pGEM—T载体中进行序列分析,结果表明该基因全长为1611bp(从ATG到S前体蛋白裂解位点),与标准株M41和Beaudette的S1基因序列相比较,同源率分别达到97．39％和97、27％。将IBV H株S1基因亚克隆到pPICZ—A表达载体,转化毕赤酵母中,SDS—PAGE实验证实了IBV H株S1基因在毕赤酵母中得以表达,进一步用鸡抗IBV血清做Westernblot检测．证实了表达产物的抗原特异性。     

抗病毒基因MxA真核表达载体的构建及在鸡细胞中的表达

将人抗病毒蛋白基因MxA与携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒重组后构建MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经PCR和酶切方法鉴定后,重组质粒在脂质体介导下转染鸡成纤维细胞和睾丸组织原代细胞,通过荧光观察,RT-PCR及细胞免疫组化检测目的基因的表达.结果表明,MxA基因片段已经被克隆到pEGFP-C1表达载体,成功构建了MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经该重组质粒转染后的鸡细胞的胞质中呈现颗粒状分布的绿色荧光,RT-PCR扩增出EGFP和MxA基因的特异性片断,免疫组化结果显示EGFP报告基因在细胞内的阳性表达,并表现出MxA的表达特征,间接证明了MxA可在鸡细胞中表达.MxA基因真核表达载体的成功构建以及在鸡细胞中的表达为进一步研究MxA基因在抗禽病毒性疾病中的应用打下了基础.     

坝上长尾鸡pmel基因核心启动子的鉴定

为探明坝上长尾鸡的前黑素小体蛋白(Pre-melanosomal protein,Pmel)基因核心启动子区,首先构建了双荧光素酶表达载体,通过脂质体瞬时转染鸡胚成纤维细胞DF1,并利用双荧光素酶检测试剂盒进行启动活性检测。成功克隆了坝上长尾鸡pmel基因5?侧翼区片段1268bp,预测启动子区(-1200–+68)含有2个CpG岛和多种转录因子结合位点,构建了9个含有不同长度pmel基因启动子片段的表达载体及1个核心启动子区突变载体,说明鸡pmel基因启动子的核心区域为-840–+68bp,其中-840–-590bp和-525–-266bp区域为正调控区,-590–-525bp区域为负调控区,多态位点(-456、-435、-410、-374和-341)对pmel基因启动子活性有较大影响。     

表达NDV-F基因重组马立克病病毒的构建及其在鸡体内外的复制

以敲除meq基因的MDV-Ⅰ型弱毒GX0101△meq为载体构建一株表达外源基因NDV-F的重组病毒。将外源基因NDV-F的ORF插入到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,扩增含有CMV启动子的NDV-F表达盒,同时扩增筛选基因Kan+表达盒,将他们插入到载体PMD18-T中。用含有MDV-US2区50bp同源臂的引物扩增串联表达盒,将产物电转进含有GX0101△meq的EL250宿主菌中,1%阿拉伯糖诱导掉阳性重组病毒基因组中的Kan+表达盒。挑选敲除Kan+表达盒的阳性克隆提取质粒,转染CEF细胞拯救重组病毒。将重组病毒腹腔注射鸡体,观察其在鸡体内的生长复制。成功拯救插入外源基因NDV-F的重组马立克病病毒rMDV-F,重组病毒在CEF细胞内能很好的复制表达且其在鸡体内也能很好的生长复制。以GX0101△meq为载体,结合Red E/T和FLP/FRT重组系统成功构建了表达外源基因NDV-F的重组病毒,为我们重组病毒的研究奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因与猪IgG Fc基因在HeLa细胞中的融合表达

根据Genbank中发表的猪IgG Fc段基因及IBV S1基因序列,设计并合成引物。以猪肝组织总RNA为模扩增出猪IgG Fc基因,以含全长IBV M41 S基因的质粒为模板扩增出IBV S1基因,分别克隆至T载体。DNA测序表明,所获得的IBV S1基因大小为1.5 kb,IgG Fc大小为1kb,序列正确。将IBV S1与IgG Fc基因串连,插入含有人组织型纤维蛋白溶酶原激活物分泌信号肽序列(tPA)真核表达载体pcDNA3.1-tPA上,在HeLa细胞上进行瞬时融合表达。经免疫荧光和斑点杂交检测,表达产物同时具有IBV S1蛋白和IgG Fc活性。     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

O型口蹄疫病毒VP1基因与大肠杆菌不耐热肠毒素LTB 基因的融合表达及表达产物的免疫原性分析

以质粒pMDTLT为模板、用PCR的方法扩增出LTB基因,然后将其插入到pETVP1质粒中VP1基因的上游,构建了含有融合基因LTBVP1的表达质粒pETLTBVP1。转化宿主菌BL21(DE3)LysS后进行诱导表达,诱导菌经SDS-PAGE显示重组蛋白以包涵体的形式表达,分子量约为39kD;Western blotting分析表明,重组蛋白能与FMDV阳性血清及兔抗霍乱毒素(CT)血清反应,说明融合蛋白保持了LTB和VP1各自的免疫学活性。小鼠免疫实验表明:该融合蛋白通过腹腔接种小鼠能诱导产生较强的免疫应答反应,免疫鼠产生的血清抗体水平高于试验中商品口蹄疫疫苗免疫组。     

Restriction map of pesticinogenicity plasmid pYP1 of Yersinia pestis

The restriction map of Yersinia pestis pesticinogenicity plasmid pYP1 has been constructed with the use of 18 restriction endonucleases. Plasmid dimensions (6.3 Md) have been specified, the genes for pesticin synthesis, for pesticin immunity protein, fibrinolysin and plasmocoagulase have been localized by molecular cloning of single plasmid DNA fragments in vector plasmid pBR322.     

白念珠菌新型耐药基因MXR1的敲除与鉴定

目的 构建用于白念珠菌MXR1基因敲除的载体质粒,并通过Ura-Blaster策略敲除MXR1两条等位基因.方法 分别扩增白念珠菌MXR1基因ORF两侧上下游的片段,通过酶切与连接反应,将上下游片段分别插入到p5921质粒的hisG-URA 3-hisG盒两端,从而形成MXR1敲除载体质粒pUC-MXR1-URA3.通过Ura-Blaster策略将载体质粒转染到白念珠菌RM 1000内,并采用PCR和Southern-blot杂交方法鉴定各步转染、复筛所得的阳性克隆.结果 成功获得MXR1基因缺失的菌株.结论 MXR1基因缺失菌株的构建,有助于深入研究白念珠菌耐药机制.     

Ⅰ型单纯疱疹病毒 gD基因片段的高效表达及抗原性分析

目的 获得高表达的Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV)被膜糖蛋白gD（简称gD1）基因的工程菌。方法 通过计算机分析,筛选出疱疹病毒gD1中优势抗原决定簇的基因片段。将克隆的基因片段插入表达载体pTrxA内,转化大肠杆菌Rosetta,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物。　结果　PCR扩增出约930bp的gD1编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建pTrxA-gD1重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pTrxA-gD1重组质粒的大肠杆菌Rosetta诱导后得到了高效达,SDS-PAGE显示表达产物约Mr48000（Dalton）。免疫印迹结果表明表达产物具有较好的抗原性。结论　成功构建了pTrxA-gD1表达质粒,实现了成熟gD1蛋白在大肠杆菌中的高效表达,表达产物具有好的抗原性。     

金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株RN4220Δnuc1的构建

金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶（Staphylococcal nuclease,SNase）,命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶（Thermonuclease,TNase）,命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个编码基因nuc1,为了进一步研究nuc2基因的功能,首先要将金黄色葡萄球菌nuc1基因缺失。本研究目的就是通过构建同源重组质粒pBT2Δnuc1,将其电转入金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,获得nuc1基因缺失突变株。经过了七轮培养和筛选,同源重组几率为2%（7/345）,筛选出的nuc1突变株用PCR方法和RT-PCR进行了验证,从而获得了nuc1基因缺失突变株RN4220Δnuc1。     

PHLCX Nflag3/小窝蛋白-1重组质粒的构建及融合基因在293T细胞中的表达

构建重组真核表达质粒PHLCX Nflag3／小窝蛋白-1,并在293T细胞中表达．用PCR的方法扩增cDNA文库中的人小窝蛋白-1基因,连接在真核表达栽体PHLCX Nflag3的短肽标签flag的下游,用限制性酶切和泖l序的方法鉴定;将重组质粒以脂质体法转染293T细胞,Western blotting法检测蛋白质的表达．结果显示,双酶切出现两个片段,分别与空栽体和人小窝蛋白-1的cDNA分子质量大小相符,测序结果符合人小窝蛋白-1的cDNA序列;Western blotting显示构建的新栽体能够在293T细胞中表达小窝蛋白-1／flag融合蛋白,表明已成功构建了能在293T细胞中高效表达小窝蛋白-1／flag融合蛋白的真核表达栽体PLHCX Nflag3／小窝蛋白-1．     

The role of transposons in replication: Tn5 suppresses ts-mutation for plasmid RP1 replication in Escherichia coli cells

Effect of restoration by transposon Tn5 of genetic damage in RP1 plasmid replication (named transposon suppression) was described. Hybrid plasmid, a derivative of RP1 and RP4, having ts mutation for replication--tsr12 and deletion in the aphA gene controlling kanamycin resistance, was constructed. Five of derivatives of this plasmid containing transposon Tn5 were made, and the strains containing both the Tn5 integrated into the chromosome and intact hybrid plasmid or the parental plasmid with the replication ts mutation, were constructed. It was shown that transposon Tn5 comprised within the hybrid plasmid or in the chromosome promotes maintenance of these replication defective plasmids in the bacterial culture at a non-permissive temperature and thus suppresses plasmid mutation tsr12. It was determined that the extent of suppression of plasmid replication ts mutation depends on the localization of transposon Tn5.