齐多夫定和单克隆抗体联合应用去除疫苗毒种中REV的污染

禽网状内皮组织增生症病毒(REV)在禽弱毒疫苗中的污染被认为是REV感染的途径之一,去除疫苗毒种中REV的污染是生产合格疫苗的前提,此前我们研究证实了某IBDV疫苗毒种存在REV的污染,本研究试图通过核苷类逆转录酶抑制剂类药物齐多夫定(Azidothymidine,AZT)和针对REV的单克隆抗体(McAb)单独或联合应用来去除疫苗毒种中REV的污染。将污染REV的IBDV疫苗毒种接种DF-1细胞后,分别经5μg/mL的AZT,5%的McAb或两者联合应用干预后,毒种中污染的REV复制受到了明显的干扰,特别是经过AZT与McAb联合应用两次干预后,检测REV为完全阴性,毒种经检验合格。本研究通过AZT与McAb联合应用成功净化了IBDV疫苗毒种中REV的污染,为解决类似问题提供了新的思路。     

敲除Meq基因的重组鸡马立克氏病毒与CVI988/Rispens疫苗株免疫保护效力的比较

【目的】比较敲除meq基因的马立克氏病毒(MDV)与标准疫苗株CVI988/Rispens对MDV超强毒GX0101攻毒的免疫保护作用。【方法】本实验将1日龄SPF鸡120只随机分成4组,每组30只,分别饲养在正压过滤空气的SPF动物饲养隔离罩内。1日龄时,第1组鸡以2000PFU/只的剂量颈部皮下接种SC9-1;第2组鸡以2000PFU/只的剂量颈部皮下接种CVI988/Rispens;第3、4组为不免疫攻毒对照组。免疫接种后5 d后,第1、2、3组分别以2000PFU/只的剂量腹腔接种MDV GX0101。饲养至90日龄,记录死亡情况,对死亡鸡只剖检,并取疑似马立克特有病变脏器做病理切片。期间,检测不同免疫状态下病毒GX0101的增殖动态以及禽流感、新城疫灭活苗在鸡体诱导产生抗体的水平。对含有MDV母源抗体的海蓝褐鸡的试验方案与SPF鸡一致。【结果】SC9-1株免疫对感染MDV GX0101攻击SPF鸡、海兰褐鸡均提供100%的免疫保护作用;CVI988/Rispens对SPF鸡、海兰褐鸡分别提供86.7%、93%的免疫保护作用。未免疫SPF鸡攻毒组死亡率为53.3%,肿瘤率为16.7%;未免疫海兰褐鸡攻毒组死亡率为36.7%,肿瘤率为6.67%;相比,空白对照组鸡只没有任何病变及死亡。荧光定量结果显示,淋巴细胞和羽毛囊DNA中,SC9-1免疫组鸡体内GX0101的病毒拷贝数显著低于CVI988/Rispens免疫组。血凝抑制试验结果显示,SC9-1免疫攻毒组鸡的产生的AIV、NDV抗体水平高于CVI988/Rispens免疫攻毒组。【结论】SC9-1株免疫无论在SPF鸡还是含有MDV母源抗体的海兰褐鸡均能提供比CVI988/Rispens更好的免疫保护效果。     

表达NDV-F基因重组马立克病病毒的构建及其在鸡体内外的复制

以敲除meq基因的MDV-Ⅰ型弱毒GX0101△meq为载体构建一株表达外源基因NDV-F的重组病毒。将外源基因NDV-F的ORF插入到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,扩增含有CMV启动子的NDV-F表达盒,同时扩增筛选基因Kan+表达盒,将他们插入到载体PMD18-T中。用含有MDV-US2区50bp同源臂的引物扩增串联表达盒,将产物电转进含有GX0101△meq的EL250宿主菌中,1%阿拉伯糖诱导掉阳性重组病毒基因组中的Kan+表达盒。挑选敲除Kan+表达盒的阳性克隆提取质粒,转染CEF细胞拯救重组病毒。将重组病毒腹腔注射鸡体,观察其在鸡体内的生长复制。成功拯救插入外源基因NDV-F的重组马立克病病毒rMDV-F,重组病毒在CEF细胞内能很好的复制表达且其在鸡体内也能很好的生长复制。以GX0101△meq为载体,结合Red E/T和FLP/FRT重组系统成功构建了表达外源基因NDV-F的重组病毒,为我们重组病毒的研究奠定了基础。