人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白的原核表达及纯化

目的:表达和纯化人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。方法:利用PCR搭接方法及基因合成方法获得目的基因,插入带有6×His标签的原核高效可溶性表达载体pET32a中,构建重组表达质粒pET32a-T9-ac-9,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导目的基因表达;对融合蛋白进行Ni2+金属螯合柱纯化。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为22.917×103;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。结论:获得了可溶性的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

人源TNFα的原核表达及活性测定

目的:利用SUMO标签构建人TNFα原核表达载体,通过表达及纯化获得重组蛋白,为深入研究和利用人TNFα奠定基础。方法:利用PCR技术,从质粒pET32a-hTNFα中扩增出人TNFα成熟肽编码序列,并在其上游添加SUMO标签,与原核表达载体pET28a连接,构建表达质粒pET28a-SUMO-hTNFα。在BL21(DE3)工程菌中表达融合蛋白,经Ni-NTA纯化体系纯化,切除SUMO标签,纯化获得hTNFα成熟蛋白。CCK-8法检测TNFα对L929细胞的细胞毒性,以测定TNFα的生物学活性。结果:成功构建pET28a-SUMO-hTNFα原核表达质粒,酶切鉴定和测序分析与预期结果完全一致。在BL21(DE3)工程菌中实现了融合蛋白的可溶性表达。经纯化、水解酶切除标签及再次纯化获得hTNFα成熟肽。CCK-8法检测得所制备的TNFα蛋白ED50约为12.8μg/ml。结论:成功构建原核表达载体pET28a-SUMO-hTNFα,经表达、纯化、酶切及再纯化,获得有生物活性的hTNFα蛋白,为深入研究和利用hTNFα奠定基础。     

sTNFR-IgGFc融合基因在内皮细胞中的表达及其对小鼠关节炎模型的基因治疗研究

可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFR)可以拮抗肿瘤坏死因子的活性,因此已被用来治疗与TNF相关的炎性疾病。本研究将sTNFR与IgGFc片段的融合蛋白基因克隆到真核表达载体pStar上,转染到人的内皮细胞中,获得了表达。表达的sTNFR-IgGFc能够拮抗TNFα对L929细胞的细胞毒活性。将该质粒DNA与脂质体混合,经尾静脉注射到Ⅱ型胶原诱导的关节炎小鼠体内后,应用RT-PCR在鼠的肝脏检测到了sTNFR-IgGFc的表达,并显著地改善了治疗组小鼠关节炎症状和病理反应。这表明抗TNF基因治疗有可能作为治疗类风湿性关节炎的新的途径。     

TNF受体（P55）胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

TNF与多种疾病密切相关。为了获得大量具有生物学活性的可溶性TNF受体用以拮抗TNF的毒性作用,在原核表达系统中表达了TNFR（P55）的胞外区与TrxA的融合蛋白。将TNFR（P55）胞外区去信号肽的前三个结构域基因克隆入融合蛋白表达载体pET-32a,在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达了TrxA-TNFR融合蛋白。表达产物以包涵体形式存在,经过变性和复性,并经镍金属鳌和柱亲和层析纯化,得到了纯度较高的可溶性受体蛋白的初纯品。免疫学实验及L929细胞体外实验均表明：该蛋白具有TNFR（P55）特异的抗原性、与TNF结合的活性以及良好的抑制TNF的TNF生物学活性。     

SA/TNFα双功能融合蛋白的克隆、表达及活性研究

目的：制备链亲合素标记的TNFα双功能融合蛋白,并对其活性进行研究。方法：构建原核表达质粒pET24a-SA-TNFα和pET21a-TNFα-SA;转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,Ni-NTA亲合层析纯化后进行透析复性;流式细胞仪检测融合蛋白对生物素化MB49细胞的锚定活性,L929细胞杀伤实验检测融合蛋白的TNFα活性。结果：成功制备了两种链亲合素标记的TNFα双功能融合蛋白SA-TNFα和TNFα-SA;其表达量分别约占总蛋白的30%和23%,纯化效率均达90%以上;两种融合蛋白均能有效地锚定于生物素化的MB49细胞表面,其锚定效率分别为95%和92%;L929细胞杀伤实验显示SA-TNFα具备TNFα活性,但TNFα-SA不具备TNFα活性。结论：成功制备了具备双功能活性的链亲合素标记的TNFα融合蛋白,TNFα在该融合蛋白中的位置与其活性有重要的关系。     

7肽和12肽两种M13噬菌体展示库筛选肿瘤坏死因子alpha拮抗肽的比较

肿瘤坏死因子alpha的拮抗剂是治疗多种炎症性自身免疫疾病的首选,但抗体类拮抗物因副作用明显而使用受限,尤其是机体内抗抗体的产生,严重影响治疗效果和药物代谢。而肽类物除免疫原性低之外,和小分子相比也有更低的毒性和更强的靶标特异性。使用7肽和12肽两种M13噬菌体展示库筛选TNFα拮抗肽,以分析7肽和12肽分别作为TNFα拮抗肽的亲和性与功能性。经过3~4轮的筛选和验证,得到2条7肽序列和2条12肽序列。利用ELISA方法检测合成肽与TNFα结合的亲和性,编号632的7肽亲和性最强,Kd=138nmol/L;编号636的12肽亲和性稍差,Kd=8.59μmol/L。InsightⅡ软件分别分析632肽和636肽与TNFα二聚体结合,发现632肽与TNFα二聚体结合更加稳定,并且在细胞水平上632肽拮抗TNFα活性功能比636肽更强,有632肽存在的条件下TNFα诱导的L929细胞生存率上升了3倍,而636肽的作用只有2倍。7肽比12肽更适合作为TNFα拮抗肽。     

MG-132提高TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞中表达的研究

目的:在不影响细胞活力的前提下,通过抑制人肿瘤坏死因子受体-Fc(TNFR-Fc)融合蛋白的降解,提高其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的产量和质量。方法:通过在细胞培养过程中加入全蛋白质合成抑制剂Cycloheximide、溶酶体抑制剂Leupeptin、蛋白酶体抑制剂MG-132,验证TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞的降解途径;免疫印迹(Western blot)方法检测在细胞内TNFR-Fc融合蛋白的变化,酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测分泌表达的TNFR-Fc融合蛋白的含量。Protein A亲和层析纯化细胞培养液上清,高效液相色谱(HPLC)检测重组蛋白的纯度,并通过阻断肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的L929细胞毒作用来检测纯化的TNFR-Fc蛋白的活性。结果:TNFR-Fc在CHO细胞内,经泛素蛋白酶体途径降解,稳定表达TNFR-Fc的CHO细胞培养过程中添加50μmol/L MG-132,可以使TNFR-Fc融合蛋白的分泌表达量提高42.35%,纯化后,二聚体比例提高28.60%,并且纯化后目的蛋白的比活性也增加。结论:在不影响细胞活力、蛋白质生物学活性的前提下,添加蛋白酶体抑制剂MG-132提高TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达量,为进一步研究从抑制蛋白质降解途径来提高重组蛋白在CHO细胞中的表达量提供了现实依据。     

利用大肠杆菌鞭毛展示的随机肽库筛选TNF—α拮抗须

TNF－α是一种在机体抗感染,抗肿瘤过程中发挥重要作用的细胞因子,其对机体具有保护和损伤两方面的作用,为了探讨新的抑制TNF－α所致炎症损伤等反应的手段,构建了细菌鞭毛递呈的随机肽库,利用构建得到的肽库,进行TNF－α特异性结合肽的筛选工作。经过5轮筛选及DNA测序,共得到6条小肽编码序列。其中2条序列中含有－V－－N－WG的相同序列框架。进行6条序列与TNF－α结合力的确证后,选择了其中的4条肽序列进行人工化学合成,纯化及鉴定。利用L929细胞及MTT法对4条小肽进行活性测定,检测其对TNF－α的抑制活性。结果表明,在TNF－α对L929细胞毒性为30％左右,含同源序列框架的2条肽可抑制90％左右的TNF－α活性。     

人修饰型降钙素和鼠酰胺化酶基因在昆虫细胞中的偶联表达

人降钙素 (hCT)是 32氨基酸的多肽激素 ,C-端为α脯氨酰胺结构 ,具有调节体内钙、磷代谢等许多重要生理功能。用重组昆虫杆状病毒表达系统 ,偶联表达合成的人修饰型降钙素 (hmCT)基因与GST融合基因和大鼠酰胺化酶 (PAM)基因 ,再用抗hmCT或抗PAM抗体 ,既检测到由昆虫细胞表达的GSThmCT产物也检测到PAM产物。经GSH 琼脂糖凝胶亲和层析 ,分离纯化GSThmCT融合蛋白。这种蛋白修饰酶与底物在真核细胞偶联表达也将适用于其他生物活性肽的体外表达     

抑制肿瘤坏死因子-α的DNA适配子的筛选与鉴定

应用SELEX技术筛选能与TNF结合的DNA适配子。化学合成随机寡聚DNA库,以TNF为靶蛋白,经过12轮SELEX筛选,将所得产物克隆、测序。根据所测序列化学合成寡聚DNA适配子,用生物素_亲和素_辣根过氧化物酶显色系统检测适配子与TNF的结合活性;用鼠L929细胞检测适配子拮抗TNF活性。结果显示,所筛选到的寡聚DNA能与TNF-α高亲和力结合,并能在细胞培养中拮抗TNF-α的细胞毒活性。     

内毒素结合肽的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

重组人内毒素结合肽 (endotoxinbindingpeptide ,EBP)融合蛋白在大肠杆菌中表达 ,分离和纯化后对其进行生物学活性观察 .将构建好的PinpointⅩa3 EBP生物素融合表达载体转化大肠杆菌DH5α ,IPTG诱导表达菌株 ,亲和层析法纯化表达产物 ,因子Ⅹa(factorⅩa)切割分离内毒素结合肽 ,采用凝胶过滤和反相液相高效色谱法两步纯化 ,从相对分子质量、N端 1 0个氨基酸的序列分析等方面进行鉴定 ;利用人单核细胞U937对重组内毒素结合肽进行了生物学活性的检测 .结果发现 ,内毒素结合肽以包涵体形式存在 ,因子Ⅹa酶切融合蛋白后得到 3 5kD的内毒素结合肽 ,纯化后内毒素结合肽纯度达 99%以上 ,N端 1 0个氨基酸的分析结果与预期相符 ;初步证实内毒素结合肽具有较好的LPS结合活性 ,能够抑制LPS的作用 .经原核表达及纯化复性 ,获得了具有较好生物学活性的内毒素结合肽 ,为进一步研究其功能奠定了良好的基础     

重组腺相关病毒2型/人肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAV2/hTNFR:Fc)的构建和生物学活性研究

为研究腺相关病毒2型载体应用于类风湿性关节炎进行基因治疗的可行性,首先构建携带人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段融合基因的重组2型腺相关病毒(rAAV2／hTNFR：Fc),并对其生物学活性进行研究。以RT—PCR分别从U937和人淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAV1载体质粒进行重组病毒生产,在进行重组病毒理化分析后,以TNFa细胞毒中和试验来研究该重组病毒的生物学活性。结果显示：所构建的重组病毒rAAV2／hTNFR：Fc基因结构与预期一致;病毒在体外感染BHK-21细胞后,含TNFR：Fc融合蛋白的表达上清可以有效中和人、大鼠、小鼠TNFα对L929的细胞毒性。所研究构建的重组腺相关病毒可以用来作为阻断TNFα的手段,进行类风湿性关节炎的基因治疗研究。     

以TNFα为基础并靶向于白细胞介素15受体的融合蛋白的构建及功能研究(英文)

IL 1 5及IL 1 5R阳性细胞在成人T淋巴细胞性白血病 (ATL)、多发性骨髓瘤及炎症性自身免疫性疾病病理过程中起着重要作用 .应用基因重组技术 ,构建、表达靶向于IL 1 5受体的两种融合蛋白 ,为研制特异的可消除IL 1 5R高表达细胞的导向药物奠定基础 .将人IL 1 5成熟肽基因及IL 1 5R拮抗剂 (IL 1 5M)基因片段分别与人工改造的人肿瘤坏死因子突变体 (TNFαM)基因按正确的阅读框架融合 ,定向克隆在pET1 6b表达载体T7启动子的下游 ,得到质粒pET IL 1 5 TNFαM和pET IL 1 5M TNFαM .从大肠杆菌相应重组菌株中通过Ni2 + NTA亲和层析分别纯化出两种融合蛋白IL 1 5 TNFαM和IL 1 5M TNFαM .IL 1 5 TNFαM和IL 1 5M TNFαM对IL 1 5R阳性红白血病细胞K5 6 2的杀伤作用分别是TNFα的 4和 1 5倍 ,两种蛋白对IL 1 5R阴性细胞系Jurkat的杀伤作用则没有明显差异且均弱于TNFα .这些结果说明 ,两种融合蛋白特别是IL 1 5受体拮抗型蛋白IL 1 5M TNFαM对与IL 1 5 IL 1 5R异常表达相关的疾病可能具有潜在的治疗价值     

内毒素结合肽模拟肽P11的体外活性研究

目的对从噬菌体展示随机肽库筛选获得的内毒素结合肽模拟肽进行体外拈抗内毒素活性鉴定。方法采用FMOC固相合成法化学合成内毒素结合肽模拟肽P11,并进行拮抗内毒素活性和细胞毒性测定。结果亲和ELISA检测显示P11与LPS有较高的亲和力,通过生长曲线和流式细胞学分析细胞周期显示P11对人U937细胞生长无明显影响。流式细胞检测显示P11呈剂量依赖性抑制FITC—LPS与人外周血单核细胞（PBMC）结合。细胞因子生成抑制实验显示10μg/mlP11可显著抑制LPS诱导PBMC和U937细胞TNF—αmRNA转录和蛋白表达。结论体外活性鉴定结果表明化学合成的模拟肽P11可抑制LPS诱导的炎性反应。     

GFE-1多肽与重组人肿瘤坏死因子α融合蛋白的构建及其体外活性和体内分布研究

目的:构建 GFE-1多肽与重组人肿瘤坏死子α(rmhTNF-α)融合蛋白(GFE-1-rmhTNF),研究该融合蛋白的体外活性和体内分布.方法:利用基工程方法,将人工合成的编码 GFE-1的寡核苷酸片段连接在 rmhTNF-α序列的3'端,转入大肠杆菌中诱导表达,采用 Q-Sepharose FF 离子层析柱和 SP-Sepharose FF 阳离子层析柱纯化蛋白,SDS-PAGE 和 Western 印迹鉴定,测定该融合蛋白的体外活性,观察其在小鼠体内的分布情况.结果:构建了融合蛋白 GFE-1-rmhTNF,并在大肠杆菌中获得高效表达.体外活性实验显示,GFE-1-rmhTNF 对 L929细胞有明显的杀伤活性;体内分布实验证实,GFE-1-rmhTNF 在小鼠肺组织的富集高肝肾组织.结论:构建了融合蛋白 GFE-1-rmhTNF,可显著杀伤 L929细胞并特异性富集小鼠肺组织.     

猪胰脏中胰岛素拮抗肽的分离纯化及其性质的初步研究

从猪胰脏的酸醇提取液中纯化了一个新的活性多肽——胰岛素拮抗肽,它在整体和细胞水平上对胰岛素都有明显的拮抗作用。猪胰脏的酸醇提取液经CM-52、BioGel P-6、DEAE-52及RP-HPLC纯化后,可得到纯的胰岛素拮抗肽。它能剂量相关地抑制胰岛素在离体大鼠脂肪细胞中的促脂合成活性,抑制50％胰岛素活性时所需的胰岛素拮抗肽为2.0×10~(-10)mol/L与被拮抗的胰岛素剂量在同一水平上。该肽含有较多的碱性氨基酸,分子量的3 000,其N-末端是封闭的。胰岛素拮抗肽的上述理化特征及其对胰岛素的拮抗活性均不同于目前已知的胰脏活性多肽。它对脂肪细胞中胰岛素的拮抗作用可能具有重要的生理意义。     

94个氨基酸的前列腺分泌蛋白与TNFα衍生物的协同抗肿瘤作用

体外研究显示,重组PSP94与重组TNFα（rhTNFαDll）有协同抗前列腺癌的作用。将编码这两种蛋白的基因与真核表达载体pcDNA3．0重组,构建成pcDNA－PSP94－TNFαDlla真核表达质粒,两基因中间通过一个编码6个氨基酸的人工接头连接。在体外,对pcDNA－PSP94－TNFαDlla质粒表达PSP94－TNFαDlla蛋白的生物学活性鉴定表明,该蛋白即具有PSPO94抑制前列腺癌细胞生长的活性,又具有TNFαDlla对L929细胞的细胞毒作用。肌肉注射该质粒DNA,注射后第0天血液中可检测到目的的蛋白的表达,目的蛋白浓度的高峰期约在注射后第14天,第25天仍可检测到目的的蛋白的表达。该质粒DNA以50μg/只的量给人前列腺癌裸鼠模型骨四头肌内注射,同时设pcDNA－PSP94、pcDNA－TNFαDlla、pcDNA3．0空载体和生理盐水对照组。注射后第20天处死动物,抑瘤率分别为：pcDNA－PSP94－TNFαDlla组24％,pcDNA－PSP94组19％,pcDNA－TNFαDlla组瘤体大小与生理盐水组无明显差异。以同样方法给药,pcDNA－PSP94－TNFαDlla质粒DNA对小鼠Lweis肺癌的抑制率31％,是pcDNA－PSP94组抑瘤率的2．2倍,是pcDNS－TNFαDlla组抑瘤率的2．1倍。提示,PSP94与TNF具有协同抗肿瘤的作用。     

PSP94-TNFαD11a融合基因在NIH3T3细胞中的表达及其产物活性分析

 为了分析 PSP94- TNFαD1 1 a融合基因的表达和表达产物的生物学活性 ,将含该融合基因的质粒 pc DNA- PSP94- TNFα D1 1 a转染 NIH3T3细胞 ,72 h后收集细胞培养上清 ,并提取细胞总RNA,经 RT- PCR,得到与目的基因长度相符合的 c DNA片段 ;以 PSP94c DNA为探针 ,对 RT-PCR产物进行 Southern印迹分析 .结果表明 :转染 PSP94- TNFαD1 1 a融合基因的 NIH3T3细胞 ,其 RT- PCR产物杂交信号为阳性 .细胞培养上清用 TNF抗体行 Western印迹和 ELISA分析 ,检测结果为阳性 .生物学活性分析表明 ,细胞培养上清不仅具有 PSP94抑制人前列腺癌细胞 PC- 3生长的活性 ,而且显示出 TNFα对 L92 9细胞的细胞毒作用 .以上结果表明 ,pc DNA- PSP94- TNFαD1 1 a质粒能够正确表达目的基因 PSP94- TNFα D1 1 a,且表达的 PSP94- TNFαD1 1 a融合蛋白具有预期的双重生物学活性 .     

利用带有原核增强子样序列的新型载体在大肠杆菌中高效表达人α肿瘤坏死因子

将去除信号肽的人肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)cDNA插入到带有原核增强子样序列Px的新型表达载体pBV320中,使TNF cDNA 5′端直接置于大肠杆菌trp启动子下游,采用37℃恒温培养,使TNF在大肠杆菌中获得了高效表达,表达活性达1.35(±0.17)×10~6U/L菌液。表达的TNF-α对L929细胞的毒性作用可被抗人肿瘤坏死因子-α的单克隆抗体所中和。表达菌裂解液作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,显示有一条分子量与TNF分子量吻合、约为17000道尔顿的蛋白带。利用DEAE-Sepharose阴离子交换层析及Sephacryl S-200凝胶过滤对上述重组人TNF-α进行纯化,获得电泳纯产品,比活性为1.48×10~6U/mg。     

天蚕素A-蜂毒素杂合肽用pBV220载体的表达、纯化和活性测定

为提高抗菌肽的表达,在抗菌肽的N端融合了1段酸性小肽以中和表达产物对宿主的毒性;并将融合肽基因同向串连成多拷贝,在大肠杆菌中获得了较高的表达。用化学合成法分别合成了编码天蚕素A(1-8)-蜂毒素(1-10)杂合肽和酸性小肽的DNA片段,首先将其拼接成融合肽的完整基因,然后通过前后接头将融合肽基因连接成两侧具有EcoRI和SalI酶切位点的同向串连的多拷贝基因。将5份拷贝的基因克隆至pBV220表达载体,转化E.coliDH5α,温度诱导得到表达量为35%的融合蛋白。表达产物主要以包涵体形式存在,将包涵体溶解,经Ni²⁺-NTA琼脂糖亲和层析获得纯化的融合蛋白。融合蛋白再经CNBr切割和阳离子交换层析,得到纯化的抗菌肽,经蛋白质N端测序确认序列正确。琼脂糖扩散法和液相测定法证明了纯化的抗菌肽具有抗菌活性。