从七肽噬菌体展示库中筛选内毒素结合蛋白质配基

目的:研究从噬茵体展示库中筛选内毒素结合蛋白质配基,为其在内毒素致病作用机理及在内毒素血症防治研究中的应用奠定基础.方法:以内毒素为靶分子从随机七肽噬菌体展示库中筛选内毒素的高亲和力噬菌体配体,通过ELISA鉴定,DNA测序及相关软件分析.结果:所筛选的亲和力最高的噬菌体的ELISA检测值A405nm可达1.965通过比较亲和性噬菌体外源插入肽的DNA序列,认为FHENWPS肽段中包含有与内毒素分子发生亲和结合的一个共有序列.该序列展示肽的等电点为5.36,具有双嗜性,这有利于肽与LPS分子表面的位点相互作用从而产生亲和吸附.结论:运用亲和筛选方法从肽库中筛选内毒素结合蛋白质配基是可行的.     

内毒素结合肽模拟肽P11的体外活性研究

目的对从噬菌体展示随机肽库筛选获得的内毒素结合肽模拟肽进行体外拈抗内毒素活性鉴定。方法采用FMOC固相合成法化学合成内毒素结合肽模拟肽P11,并进行拮抗内毒素活性和细胞毒性测定。结果亲和ELISA检测显示P11与LPS有较高的亲和力,通过生长曲线和流式细胞学分析细胞周期显示P11对人U937细胞生长无明显影响。流式细胞检测显示P11呈剂量依赖性抑制FITC—LPS与人外周血单核细胞（PBMC）结合。细胞因子生成抑制实验显示10μg/mlP11可显著抑制LPS诱导PBMC和U937细胞TNF—αmRNA转录和蛋白表达。结论体外活性鉴定结果表明化学合成的模拟肽P11可抑制LPS诱导的炎性反应。     

内毒素结合肽的改良、原核表达及纯化

目的：对人内毒素结合肽(endotoxin binding peptide,EBP)进行改良,获得突变体mEBP(mutate of endotoxin binding peptide,mEBP)基因并进行原核表达,纯化获得高纯度的mEBP。方法：应用PCR定点诱变方法获得mEBP基因,构建PinpointXa-3/mEBP融合表达载体,在BL21(DE3) pLysS宿主菌进行表达,溶菌酶裂解法提取包涵体,融合蛋白经PinpointTM Xa 纯化后,由factorXa酶切,获得目的肽,RP-HPLC纯化获得高纯度的mEBP。结果 应用PCR定点诱变技术完成了EBP第5.18位谷氨酰胺 赖氨酸的定点突变,且通过原核表达,色谱纯化获得了高纯度的mEBP。结论 成功获得高纯度的mEBP,为下一步的抗内毒素功能检测奠定基础。