从七肽噬菌体展示库中筛选内毒素结合蛋白质配基

目的:研究从噬茵体展示库中筛选内毒素结合蛋白质配基,为其在内毒素致病作用机理及在内毒素血症防治研究中的应用奠定基础.方法:以内毒素为靶分子从随机七肽噬菌体展示库中筛选内毒素的高亲和力噬菌体配体,通过ELISA鉴定,DNA测序及相关软件分析.结果:所筛选的亲和力最高的噬菌体的ELISA检测值A405nm可达1.965通过比较亲和性噬菌体外源插入肽的DNA序列,认为FHENWPS肽段中包含有与内毒素分子发生亲和结合的一个共有序列.该序列展示肽的等电点为5.36,具有双嗜性,这有利于肽与LPS分子表面的位点相互作用从而产生亲和吸附.结论:运用亲和筛选方法从肽库中筛选内毒素结合蛋白质配基是可行的.     

内毒素结合肽模拟肽P11的体外活性研究

目的对从噬菌体展示随机肽库筛选获得的内毒素结合肽模拟肽进行体外拈抗内毒素活性鉴定。方法采用FMOC固相合成法化学合成内毒素结合肽模拟肽P11,并进行拮抗内毒素活性和细胞毒性测定。结果亲和ELISA检测显示P11与LPS有较高的亲和力,通过生长曲线和流式细胞学分析细胞周期显示P11对人U937细胞生长无明显影响。流式细胞检测显示P11呈剂量依赖性抑制FITC—LPS与人外周血单核细胞（PBMC）结合。细胞因子生成抑制实验显示10μg/mlP11可显著抑制LPS诱导PBMC和U937细胞TNF—αmRNA转录和蛋白表达。结论体外活性鉴定结果表明化学合成的模拟肽P11可抑制LPS诱导的炎性反应。     

新型重组人内毒素结合肽突变体的构建及原核表达纯化

目的构建新型人内毒素结合肽（a new endotoxin binding peptide consisting of 25 amino acid residues,EBP25）及其突变体（mutant of EBP25,mEBP25）的原核表达重组质粒,并在大肠埃希菌中诱导表达。方法采用PCR法,扩增EBP25基因,构建pET-30-EBP25.融合表达载体并转化Ecoli DH5α扩增。重组质粒经酶切和测序鉴定后,应用快速定点突变法将EBP25第2位缬氨酸和第5位谷氨酰胺所对应碱基均替换成赖氨酸所对应的碱基,突变后重组质粒再经测序鉴定后,将二者转化至E．coli BL21（DE3）PlysS后经IPTG诱导表达,表达产物采用Western印迹进行鉴定后,用His—Tag亲和层析对融合蛋白进行纯化。结果两次测序结果显示人EBP25,和mEBP25重组序列和理论设计序列完全一致后,经IPTG诱导表达获得目的融合蛋白,通过SDS—PAGE电泳、Western印迹证实蛋白表达的特异性,并对蛋白进行纯化,获得EBP25和mEBP25融合蛋白。结论构建、表达纯化了EBP25和mEBP25融合蛋白,为进一步研究其中和内毒素／月旨多糖活性奠定了基础。