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大鼠甘氨肽酰化单氧酶在CHO细胞中的活性表达及在体外酰胺化修饰中的应用 总被引:1,自引:0,他引:1
将大鼠脑cDNA库来源的PAM基因片段,经克隆重组,构建成真核表达质粒pSV—PAM,并转染CH0细胞,获得在cHO中稳定表达活性型口α-酰胺化酶的细胞株DGAE。表达产物为双功能酶,分泌至培养基中的酶活力远高于胞内。体外酰胺化加工研究表明,以α—N—acetyl-Tyr-Val-Gly为底物,该酶催化反应的Km为12.Sμmol/L,Vmax为180μmol/mg/h,而且催化反应中表现有最适铜离子浓度和pH值范围。表达的双功能酶可直接用于合成的多肽和基因工程表达产物的酰胺化加工修饰。 相似文献
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α-酰胺化是神经和内分泌系统中许多生物活性肽重要的翻译后加工过程,由酰胺化酶PAM催化完成.PAM是一个双功能酶,含有两个催化结构域:PHM和PAL,顺序催化酰胺化两步反应.PAM的mRNA和蛋白质具有多样性.作为活性肽生物合成途径中的限速酶,PAM的表达及活力水平具组织特异性,受激素及发育中的相关因素的调节. 相似文献
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将cAMP依赖的蛋白激酶(cAPK)识别的特征底物序列与噬菌体外膜蛋白g3p融合,展示于线状噬菌体fd的表面,构建了cAPK底物(PKS)噬菌体.噬菌体体外磷酸化标记结果表明,PKS噬菌体上分子量约为60ku的蛋白可被明显磷酸化标记,与PKS-g3p融合蛋白的分子量一致.利用金属离子(Fe3+)配体树脂亲和筛选经cAPK磷酸化标记的Phage display随机15肽库,4轮筛选后挑取单克隆进行DNA序列测定,确定展示于噬菌体表面的多肽序列.结果表明,在所挑选的14个克隆中有5个克隆具有典型的cAPK磷酸化序列特征(R)RXS/T.对这些噬菌体的体外磷酸化标记实验结果显示,其中有(R)RXS/T序列特征的噬菌体可在分子量约60ku处被特征性磷酸化标记,与PKS噬菌体的磷酸化标记特征一致;其他有一些不具备(R)RXS/T序列特征的噬菌体也可被特征性磷酸化. 相似文献
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牛生长激素释放因子的融合表达及其产物的化学加工 总被引:2,自引:0,他引:2
通过寡核苷酸引导的定位突变,在人工全合成的第27位为Ile的牛生长激素释放因子[Ile27]bGRF(1-44)OH基因的5'端ATG后插入Trp密码子序列,并分别了构建了Pl promoter控制下、以β-半乳糖苷酶和protein A结合IgG domainB、C为载体蛋白的融合型基因表达质粒pBLE310和pBLPAE2D,在大肠杆菌中得到高效表达。经SDS-PAGE分析,表达产物β-Gal 相似文献
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鸡马立克氏病病毒B抗原片段在大肠杆菌中表达 总被引:1,自引:0,他引:1
鸡马立克氏病病毒BamHI基因文库I3质粒中含有编码B抗原膜外Domain的DNA序列。经ScaI和SphI双酶酶解I3质粒,分离获得764bpDNA片段,并克隆进M13mp19中。DNA序列测定分析表明克隆片段为MDV-B抗原基因的494-1258bp部分序列。进一步分离NcoI-HindIII部分基因片(530bp),克隆于PLPromoter控制下的含有修饰型cIts857基因的表达载体中, 相似文献
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将小鼠cAMP依赖的蛋白激酶(cAPK)催化亚基α(mCα)分别以成熟、麦芽糖结合蛋白(MBP)融合以及N端连续六个组氨酸(His_6)融合的形式在大肠杆菌中得到了高效表达,且成熟及融合的重组mCα均有明显的蛋白激酶活性,表明蛋白激酶催化核心结构具有相对的独立性。其中His_6-mCα可利用金属离子(Ni ̄(2+))配体亲和层析(Ⅰ-MAC)一步纯化,所得融合蛋白可通过His_6亲合手臂(Tag)固相化于金属离子(Ni ̄(2+))配体亲和树脂上,为进一步利用PhageDisplay多肽库筛选cAPK识别的底物序列和专一性抑制剂打下了基础。 相似文献
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大鼠甘氨肽酰化单氧酶基因的克隆与表达 总被引:1,自引:0,他引:1
本文采用原位杂交及PCR方法,从大鼠脑cDNA库中,筛选到3个大鼠甘氨肽酰化单氧酶(rPAM)基因片段。经DNA全序列分析表明,它们跨越rPAM-2全部编码区。通过点突变、PCR重组技术等,分别拼接出此双功能酶的rPHM(氧化酶)、rPAL(裂解酶)及其rPAM全酶基因,并构建了多种大肠杆菌表达质粒。经温敏诱导。高效表达了rPAM-N260片段,并制各获得阳性抗血清,可用于免疫检测天然或重组的PAM。而SDS-PAGE和Westernblot分析结果显示,rPHM和rPAM在大肠杆菌中均获得了表达,其中rPHM表达量占全菌总蛋白的10%以上。进一步研究还发现,通过采用低温和加二价铜离子诱导表达,可提高rPHM产物的可溶性及稳定性。 相似文献
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