不同型别的基因工程干扰素抗病毒活性的比较

对大肠杆菌生产的不同型别的基因工程干扰素rIFN-α1(α1)、rIFN-αA(αA)、rIFN-β17ser(β17ser)和rIFN-γ(γ),以及自然人白细胞干扰素nIFN-αco,在不同细胞上对不同病毒的抗病毒活性做了比较研究。证明:①α1抗病毒作用的细胞谱较广,尤其在牛肾MDBK细胞和猪肾PK细胞上有很高的活性,分别为在人细胞上的29倍和7倍。β17ser和γ在异种细胞上活性极低,在鼠、猪和牛肾细胞上的活性为人细胞上的1～2％以下。②5种干扰素对麻疹、CoxB1、Sindbis、腺病毒7型和Ⅰ、Ⅱ型单纯疱疹病毒的抗病毒活性无明显差异。但不同病毒对干扰素的敏感性有明显差别,以Sindbis病毒为最敏感,7型腺病毒最不敏感。③5种干扰素对流行性出血热病毒均有明显的抗病毒作用,尤以人α1型和β干扰素作用最强,α1对出血热病毒的抗病毒活性是对滤泡性口膜炎病毒(VSV)的1/2.85,人β干扰素是对VSV的1/4.1。上述结果为人基因工程干扰素的临床应用提供了实验依据。     

利用带有原核增强子样序列的新型载体在大肠杆菌中高效表达人α肿瘤坏死因子

将去除信号肽的人肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)cDNA插入到带有原核增强子样序列Px的新型表达载体pBV320中,使TNF cDNA 5′端直接置于大肠杆菌trp启动子下游,采用37℃恒温培养,使TNF在大肠杆菌中获得了高效表达,表达活性达1.35(±0.17)×10~6U/L菌液。表达的TNF-α对L929细胞的毒性作用可被抗人肿瘤坏死因子-α的单克隆抗体所中和。表达菌裂解液作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,显示有一条分子量与TNF分子量吻合、约为17000道尔顿的蛋白带。利用DEAE-Sepharose阴离子交换层析及Sephacryl S-200凝胶过滤对上述重组人TNF-α进行纯化,获得电泳纯产品,比活性为1.48×10~6U/mg。     

噬菌体显示技术改造人干扰素α1c/86D的研究

利用噬菌体表面显示技术表达具生物活性的干扰素α1c,并通过构建和筛选突变文库 ,以得到高受体结合能力和高比活性的新α1c干扰素 .利用噬菌粒载体pCANTAB5E表达了人IFNα1c/ 86D基因 ,利用随机 6肽库和干扰素的中和抗体推导干扰素α1c的受体结合区及关键性结合残基 ,运用盒式突变构建了基于AB环的突变库 ,其中氨基酸 2 9,3 1,3 2 ,3 5位完全随机化 ,并直接利用WISH细胞选择出高抗病毒活性的干扰素突变体 .结果获得了 3个重组噬菌体干扰素突变体 ,其抗病毒活性是干扰素母体的 4～ 16倍 .这一结果为国内外首次报道利用噬菌体表面显示技术的筛选表达优势改造干扰素以提高抗病毒活性 ,实验结果说明了其可行性 ,并提示干扰素突变体的比活性有可能较母体高 .     

人β干扰素N端序列的变异与其抗病毒活性的关系

研究了人β干扰素N端序列的变异与其抗病毒活性的关系。采用DNA重组技术获得了两种干扰素变种:一种N端序列为MWIRGF,另一种为MAIRGF。这两种干扰素变种的抗病毒活性都明显下降。此结果提示,人β干扰素的N端序列对抗病毒活性起主导作用,在改造该蛋白结构时,应避免改动N端结构。     

人γ干扰素（IFN－γ）－表皮生长因子（EGF）融合蛋白的抗肿瘤细胞增殖作用与靶细胞的EGF受体有关

采用表皮生长因子（ＥＧＦ）受体丰富的Ａ４３１细胞进一步研究了人ＩＦＮ－γ－ＥＧＦ３融合蛋白￣〔１〕的抗细胞分裂活性,以及它和靶细胞ＥＧＦ受体的关系。结果表明,ＩＦＮ－γ－ＥＧＦ３融合蛋白的抗肿瘤细胞增殖作用明显高于其母体分子。￣１２５Ｉ－ＥＧＦ受体竞争抑制试验表明,ＩＦＮ－γ可与ＥＧＦ竞争Ａ４３１细胞的ＥＧＦ受体,而ＩＮＦ－γ－ＥＧＦ３融合蛋白的ＥＧＦ受体竞争抑制作用更为明显,说明人ＩＦＮ－γ和ＩＦＮ－γ－ＥＧＦ３融合蛋白的抗肿瘤细胞分裂活性,与靶细胞ＥＧＦ受体被竟争抑制密切相关。     

小鼠单链抗体文库的构建和抗人的IFNα-1b抗体的筛选

小鼠单链抗体文库的构建和抗人的ＩＦＮα－１ｂ抗体的筛选杜东毅马学军张丽兰郭德本侯云德（中国预防医学科学院病毒学研究所,北京１０００５２）关键词噬菌体表面呈现,抗体库,ｒＩＦＮα－１ｂ（重组干抗素α１ｂ）目前,抗体的研究与生产主要依赖于单克隆抗体技术,...     

应用痘苗病毒载体在动物细胞中高效表达人α-瘤坏死因子cDNA及其特性的研究

构建了含不同长度的人α-肿瘤坏死因子(hTNF-a)cDNA的两种重组痘苗病毒。hTNF-α cDNA插入痘苗病毒(天坛株)的tk区,在11k启动子的控制下,表达量可达1.6×10~7U/L,如果缩短hTNF-α cDNA起始密码子ATG与启动子之间距离并去除3′端非编码区,可使hTNF-α的表达量提高3倍。表达产物的细胞毒活性可被抗hTNF-α单克隆抗体所中和,免疫沉淀产物的SDS-PAGE有一特异性17kD的蛋白条带;同时,在细胞毒活性相同的前提下,哺乳动物细胞表达的hTNF-α的抗病毒活性高于大肠杆菌表达的hTNF-α。     

应用实时定量PCR技术研究人重组干扰素α2b在人群中对麻疹病毒和风疹病毒的抑制作用

麻疹病毒(measles virus)是一种导致麻疹的副粘病毒科麻疹病毒属的单股负链RNA病毒.麻疹是儿童最常见的一种急性呼吸道传染病.临床上以发热、上呼吸道炎症、结膜炎、口腔粘膜斑及全身丘疹为特征[1].风疹病毒(rubella virus,RUV)属于披膜病毒科风疹病毒属.孕妇特别是怀孕3个月以内的孕妇感染风疹病毒后,可以引起胎儿畸形.麻疹病毒和风疹病毒的实验室检测包括病毒分离、病毒特异性IgM的检测、分子杂交直接检测病毒RNA、RT-PCR、RT-nested PCR(RT-nPCR)等[2-3].     

Engineering human interferon α1c/86D with phage display technology

Human interferon-α1c/86D (IFNα1c/86D) was functionally displayed on the surface of the filamentous bacteriophage using a phagemid vector system (pCANTAB5E). The key amino acid residues involved in the receptor binding were further defined with phage displayed 6-mer peptide library and two neutralizing antibodies against linear epitopes on the IFN-α1b, indicating that residues 30, 33, 34, (AB-loop) and residues 124, 126, 127 (D helix, DE-loop) were more critical than the adjacent residues for recognition of receptor. In addition, a cassette mutagenesis library was generated by fully randomizing the sequence of the four positions 29, 31, 32 and 35 in AB-loop, and used to select phage-IFN variants with WISH-hased panning method. Three phage-IFN variants were isolated to possess more antiviral activity in the range of 4—16-fold than parental phage-IFN after IPTG-induced soluble expression. The results suggest that phage displayed phage-IFN α1c/86D variants with increased specific activity might be obta