FOXO3a反馈上调人表皮生长因子受体3表达介导HER2+乳腺癌细胞酪氨酸激酶抑制剂治疗耐受

近年来，酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKI）类药物治疗HER2+乳腺癌进展迅速，但出现治疗耐受仍是迫切需要解决的问题。本研究采用TKI（AEE788、Lapatinib）处理HER2+乳腺癌细胞BT474和SKBR3，发现HER3在mRNA和蛋白质水平上的表达均上调。MTS及克隆形成实验结果显示，siRNA干扰HER3的表达能够显著抑制BT474、SKBR3细胞的增殖，表明干扰HER3可增强细胞对TKI的敏感性。为进一步考察TKI促进HER3表达的可能机制，Western 印迹及免疫荧光检测发现，AEE788、Lapatinib能够上调FOXO3a的表达且促进其入核。干扰FOXO3a可逆转TKI对HER3的诱导作用，说明TKI通过激活FOXO3a上调HER3的表达。综上所述，FOXO3a反馈上调HER3表达介导HER2+乳腺癌细胞TKI治疗耐受。这一研究发现，为临床解决TKI治疗耐受提供一定的理论基础。     

人源TNFα的原核表达及活性测定

目的:利用SUMO标签构建人TNFα原核表达载体,通过表达及纯化获得重组蛋白,为深入研究和利用人TNFα奠定基础。方法:利用PCR技术,从质粒pET32a-hTNFα中扩增出人TNFα成熟肽编码序列,并在其上游添加SUMO标签,与原核表达载体pET28a连接,构建表达质粒pET28a-SUMO-hTNFα。在BL21(DE3)工程菌中表达融合蛋白,经Ni-NTA纯化体系纯化,切除SUMO标签,纯化获得hTNFα成熟蛋白。CCK-8法检测TNFα对L929细胞的细胞毒性,以测定TNFα的生物学活性。结果:成功构建pET28a-SUMO-hTNFα原核表达质粒,酶切鉴定和测序分析与预期结果完全一致。在BL21(DE3)工程菌中实现了融合蛋白的可溶性表达。经纯化、水解酶切除标签及再次纯化获得hTNFα成熟肽。CCK-8法检测得所制备的TNFα蛋白ED50约为12.8μg/ml。结论:成功构建原核表达载体pET28a-SUMO-hTNFα,经表达、纯化、酶切及再纯化,获得有生物活性的hTNFα蛋白,为深入研究和利用hTNFα奠定基础。     

利用TNF-α诱导建立结肠癌细胞HCTll6体外侵袭模型

该研究利用TNF—α诱导建立肿瘤细胞体外侵袭模型,为进一步的研究提供基础。利用20ng／mLTNF-α刺激结肠癌细胞HCTll67d后,使用流式细胞术检测NHCTll6细胞的CCR7和CXCR4受体表达量的变化,并利用Transwell小室检测TNF—α刺激对CCL21、SDF－1介导的细胞迁移与侵袭能力的影响。实验结果显示,20ng／mLTNF－α刺激7d后的HCTll6细胞的CCR7和CXCR4表达量均显著增加,侵袭能力也增强,且使CCL21、SDF—1介导的细胞迁移与侵袭能力显著增强。结果说明了本实验利用TNF—α诱导HCTl16细胞,成功建立了HCTl16的体外侵袭模型,为接下来的研究提供了细胞模型基础,也为进一步的药物筛选提供了基础。     

利用TNF-α诱导建立结肠癌细胞HCT116体外侵袭模型

该研究利用TNF-α诱导建立肿瘤细胞体外侵袭模型,为进一步的研究提供基础。利用20 ng/mL TNF-α刺激结肠癌细胞HCT116 7 d后,使用流式细胞术检测HCT116细胞的CCR7和CXCR4受体表达量的变化,并利用Transwell小室检测TNF-α刺激对CCL21、SDF-1介导的细胞迁移与侵袭能力的影响。实验结果显示,20 ng/mL TNF-α刺激7 d后的HCT116细胞的CCR7和CXCR4表达量均显著增加,侵袭能力也增强,且使CCL21、SDF-1介导的细胞迁移与侵袭能力显著增强。结果说明了本实验利用TNF-α诱导HCT116细胞,成功建立了HCT116的体外侵袭模型,为接下来的研究提供了细胞模型基础,也为进一步的药物筛选提供了基础。