SARS-CoV N蛋白抗原表位的筛选和鉴定

利用噬菌体展示的线性12肽库从马抗SARS-CoV IgG筛选SARS-CoV的抗原表位.经生物淘洗富集的噬菌体克隆被测序.获得两个共有序列DXXDP和TXTLL.它们分别与SARS-CoV N蛋白341-345和392-396位氨基酸序列高度同源.含共有序列的克隆在ELISA竞争抑制试验中与SARS-CoV N蛋白竞争结合马抗SARS-CoVIgG.将两个共有序列肽通过基因重组技术成功展示到大肠杆菌鞭毛,获得重组菌F1和F2.用重组菌F1和F2免疫接种试验Balb/c小鼠产生的血清均能与SARS-CoVN蛋白特异结合.说明DXXDP和TXTLL是SARS-CoVN蛋白的两个连续抗原表位.     

核糖开关的研究及应用

核糖开关是一类自然界中天然存在的适配子,通过结合小分子代谢物调控基因的表达。它位于特定的mRNA非编码区,可以不依赖任何蛋白质因子而直接结合代谢物并发生构象变化,在转录和翻译水平上参与调控生物的基本代谢途径。目前已知核糖开关不仅广泛存在于细菌的代谢相关基因中,还存在于某些真菌和植物中。对核糖开关的深入研究将为基因功能研究、生物传感器研发以及新型抗菌药物开发等提供新的途径。     

以完整细胞为靶子的SELEX技术研究进展

指数富集的配体系统进化（SELEX）是一种从大容量寡核苷酸文库中经反复分离扩增步骤得到针对靶分子的高亲和力、高特异性核酸配基——适配体的体外筛选技术。自1990年以来,SELEX技术得到了迅猛发展,筛选的靶分子已由最初的单一物质发展到完整的动物细胞、细菌病原体等复杂靶子。以完整细胞为靶子的SELEX技术有其独特的技术优势,可以在筛选细胞上特定靶分子未知的情况下进行筛选,为药物筛选、临床诊断、疾病治疗和基础医学研究等带来了新的思路和方法。随着对适配体研究的深入,尤其是纳米材料与其相结合应用,该技术将在肿瘤诊断治疗及微生物检测领域具有更为广泛的应用前景。     

含p53保守结合位点的microRNA表达载体的构建及应用

目的:构建含p53保守结合位点的microRNA(miRNA)表达载体,促进相关miRNA在具有野生型p53蛋白细胞中的高效表达。方法:改构miRNA表达载体pCMV-miR,在其多克隆位点前插入p53保守结合位点,分别将miR-138、miR-34a和miR-21前体序列pre-miR-138、pre-miR-34a和pre-miR-21插入上述改构的载体pCMV/p53-miR,将构建的pCMV/p53-miR-138、pCMV/p53-miR-34a和pCMV/p53-miR-21表达载体转染具有野生型p53的HeLa细胞和不表达p53的H1299细胞,分析p53对上述miRNA表达调控的影响。结果:转染改构的miRNA表达载体后,HeLa细胞中miR-138、miR-34a和miR-21的表达水平明显提高,它们对应的已知靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN的表达同时被显著下调。结论:在p53转录调控作用下,具有p53保守结合位点的miRNA表达载体能够更加有效地提高miRNA的表达水平;构建的载体不但可用于促进相关miRNA的表达,也能用于miRNA是否受p53调控的检测。     

Vasorin基因稳定敲除HepG2细胞株的建立及其生物学功能研究

目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人Vasorin(VASN)基因稳定敲除的HepG2细胞株,并研究VASN蛋白对细胞增殖和迁移等生物学功能的影响。方法:根据人VASN序列设计向导RNA,将其克隆至表达载体pCas-Guide,获得质粒pCas-gRNA;PCR扩增VASN编码基因左、右同源臂及潮霉素B抗性基因,通过重叠PCR将三者拼接为一条片段,并克隆至载体pBackZero-T,获得质粒pBackZero-T-VASN;上述2种重组质粒共转染HepG2细胞,经潮霉素B筛选,通过基因组PCR、RT-q PCR和Western印迹实验检测VASN基因是否被敲除。利用CCK-8法和Transwell法检测VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力。结果:向导RNA表达质粒pCas-gRNA和DNA供体质粒pBackZero-T-VASN构建成功;基因组PCR结果显示,潮霉素B基因正确重组至VASN基因中;RT-PCR显示VASN m RNA水平显著降低,Western免疫印迹结果显示VASN蛋白表达水平显著降低;VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力比野生型细胞明显减弱。结论:构建了pCas-gRNA和pBackZero-T-VASN质粒,获得了VASN缺失的细胞株,验证了VASN蛋白参与细胞的增殖和迁移过程,为深度探讨VASN的生物学功能及其分子机制奠定了基础。     

人酸性成纤维细胞生长因子神经营养作用的初步研究

本实验研究了人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF)的体外神经营养作用。结果表明,haFGF在体外能明显促进鸡胚(E-8)脊髓组织神经突起的生长,并能明显改变新生大鼠脑星形胶质细胞的形态,使扁平、多角形紧密联接的细胞转化为具有纤维样突起的胶质细胞,同时对胶质细胞DNA合成也有一定促进作用。实验还证明,haFGF可增加体外培养新生大鼠海马神经元的存活,且大大增加神经元胞体体积及突起长度。     

重组人骨形态发生蛋白-2生物学活性测定新方法的建立

目的:采用小鼠异位成骨技术及甲基麝香草酚蓝比色法检测重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)的生物学活性。方法:将rhBMP-2埋入小鼠肌间隙内,14d后取出新生组织,采用血清钙试剂盒检测其钙含量。结果:随着给药组剂量递增,相应地钙含量也增加,二者具有较强的量效关系。结论:此方法为本实验室独创,较传统的血清碱性磷酸酶方法更为方便、快捷,是一种能够定量检测rhBMP-2活性的新方法。     

小鼠神经生长因子直接竞争酶联免疫检测方法的建立

目的:利用小鼠神经生长因子(mNGF)和纯化的兔抗mNGF IgG,建立mNGF直接竞争酶联免疫检测方法。方法:以亲和纯化兔抗mNGF IgG作为包被抗体,封闭、洗涤后加入用稀释液稀释的不同浓度的标准mNGF或样品液和生物素标记的mNGF混合液,于37℃孵育80 min或室温孵育120 min,洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素,洗涤后加入显色液显色,测定D450nm值,通过标准曲线计算待测样品中mNGF含量。结果与结论:建立了mNGF直接竞争酶联免疫检测方法;该方法的灵敏度约20 ng,变异系数为批内≤10%、批间≤15%,回收率为85%～115%;利用该方法检测了3批样品中mNGF的含量。     

人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白的原核表达及纯化

目的:表达和纯化人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。方法:利用PCR搭接方法及基因合成方法获得目的基因,插入带有6×His标签的原核高效可溶性表达载体pET32a中,构建重组表达质粒pET32a-T9-ac-9,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导目的基因表达;对融合蛋白进行Ni2+金属螯合柱纯化。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为22.917×103;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。结论:获得了可溶性的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

应用噬菌体展示技术筛选人巨细胞病毒糖蛋白M新的中和抗原表位

人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白复合物Ⅱ包括两种蛋白,即糖蛋白M(gM)和糖蛋白N(gN)．尽管来自于HCMV阳性病人血清中的糖蛋白复合物Ⅱ的IgG抗体能够中和HCMV粒子,但迄今为止,还没有gM中和性抗原表位的相关研究．应用消减杂交技术,通过噬菌体肽库筛选获得gM抗原的一个表位,即MAD．MAD氨基酸序列与gM第32～38位序列高度同源．将MAD与钥孔血蓝蛋白偶联免疫小鼠可产生抗MAD多抗,该多抗不仅结合天然HCMV病毒粒子,而且特异结合重组表达的gM30～78多肽．ELISA结果表明MAD能够特异结合HCMV阳性的病人血清．病毒中和实验结果进一步证明抗MAD多抗能够抑制HCMV AD169株病毒感染人胚肺细胞．总之,MAD表位有可能成为HCMV病毒疫苗潜在的保护性抗原.