大肠杆菌poly(A)化mRNA基因的芯片制备

利用大肠杆菌mRNA中存在的一定程度的poly(A)现象,利用oligo(dT)与poly(A)特异结合的特性,纯化并逆转录mRNA,并应用RD-PCR双方法获得了170多条大肠杆菌poly(A)化mRNA的基因片段,利用这些片段打印成基因芯片,以供后续大肠杆菌的基因表达研究。     

应用限制性显示PCR技术构建细菌poly(A)化mRNA的cDNA文库

针对细菌mRNA poly(A)化位点的高度多态性,利用oligo(dT)与poly(A)特异结合的特性,以oligo(dT)一纤维素纯化mRNA,并以oligo(dT)18为引物逆转录合成cDNA,用限制性内切酶消化cDNA,所得的限制性内切酶片段与通用接头相连,通过10个选择性引物组合进行选择性PCR,使各片段得以扩增并分布于10个亚组中,并进行克隆,成功地克隆了100多个基因片段,已对其中40个进行了测序分析,探讨了限制性显示PCR技术在细菌poly(A)化mRNA cDNA库构建中的应用价值。     

大肠杆菌murB和birA基因的转录通读现象

在对应用限制性显示 PCR技术构建的大肠杆菌 poly(A)化mRNA的cDNA文库鉴定中 ,发现了一克隆的基因片段同时跨越了murB和birA基因的部分序列 ,提示这 2个基因存在转录通读现象 ,设计引物 ,利用逆转录后的产物为模板 ,进行了验证。结果表明murB和birA基因存在转录通读现象。     

用钙沉淀法分离植物poly(A)-mRNA

本文对Lendes等人用钙沉淀poly(A)—mRNA的方法作了改进。在不加poly(A)的情况下,适当增加总RNA浓度,用15mM CaCl_2沉淀poly(A)—mRNA。使用改进的方法能够得到大量的poly(A)—mRNA。用改进法制各的poly(A)—mRNA;可以用poly(U)—Sepharose4β或oligo (dT)—Cellulose亲和层析作进一步的纯化,也可以直接作为反转录或翻译的模板.     

体内转录的多聚腺苷酸加速外源基因mRNA的出核转运

目的:探索体内转录的短多聚腺苷酸[poly(A)]对外源基因mRNA的表达及出核转运的影响。方法:构建依赖于H1启动子体内转录的poly(A)载体,用脂质体转染方法将其与外源绿色荧光蛋白(GFP)基因表达质粒导入MCF-7细胞,采用qPCR和Western印迹分别检测GFP在mRNA和蛋白水平的表达情况,并通过体外实验检测体内转录的poly(A)对GFP mRNA的加尾影响;采用qPCR法考察16种内源基因的mRNA水平;将其与p53表达质粒共转染MCF-7细胞后,采用MTT法检测细胞增殖情况。结果:在MCF-7细胞中,依赖于H1启动子转录的poly(A)能够加速外源GFP mRNA的poly(A)加尾,促进其从细胞核向细胞质输出,从而提高12 h内GFP的表达量,对内源基因mRNA水平没有影响;它还能加速外源p53基因的表达。结论:建立了通过体内转录poly(A)从而加速外源基因表达的策略,可能对基因治疗或快速研究某个特异基因的功能具有重要的应用价值。     

ATP：RNA腺苷酰转移酶的纯化及其应用

绝大多数真核细胞mRNA的3＇-端带有一段多聚腺苷酸即poly(A)的结构,在基因工程的研究中经常以这样的mRNA作为模板,以寡聚(dT)12—18作为引物,通过反转录酶的作用得到互补于该mRNA的DNA(即cDNA),再经克隆增殖等技术可得到相当量的基因,从而能进一步进行各种研究。近年来这些技术也常用于病毒RNA基因组的研究。Devos等人利用ATP:RNA腺苷酰转移酶使3＇端无poly(A)的病毒RNA基因加上一段poly(A),     

凝乳酶原mRNA的分离及其cDNA克隆的鉴定

用异硫氰酸胍法从牛胃粘膜组织中分离到poly(A)RNA。经电泳分析、体外翻译活性分析及No rIhern转移杂交分析,结果表明,poly(A)RNA中含有完整的,具有生物活性的凝乳酶原mRNA,大小为16S。从poly(A)RNA建立的cDNA库中,以C500-pepsinogen为探针进行初级筛选,集中阳性克隆成为凝乳酶原和相关胃蛋白酶原cDNA富集库。从寓集库中选出插入片段带有凝乳酶原基因所特有的EcoRI切点的19个克隆。经限制性内切酶谱分析确定pcT 5为凝乳酶原基因克隆,其5’端缺少80bP。以pCT 5的插入片段为探针,从cDNA库中进一步筛选得到pCTl5。酶谱分析表明,pcTl5的两端均足以覆盖编码区域,而在917位左右约有110bP的缺失。从而不仅充分证明了分离的poly(A)RNA中含有全链长的凝乳酶原mRNA,而且还可通过拼接pCT5及pCTl5获得完整的凝乳酶原基因。     

RNA结合蛋白PABPC1的功能及生物学作用

多聚腺苷酸结合蛋白(poly (A) binding protein,PABP)家族通常被认为是mRNA poly (A)尾的一种保护屏障.其中细胞质多聚腺苷酸结合蛋白1 (cytoplasmic poly (A) binding protein-1,PABPC1)在高亲和力作用下能够与mRNA中富含腺苷酸的序列结合,在基因转录后调控中发挥着重要作用.同时PABPC1还参与mRNA的许多代谢通路,包括腺苷酸多聚化/脱腺苷酸化、m RNA转运、m RNA翻译、降解及mircoRNA相关调控.近年来关于PABPC1与生殖细胞的发育、心肌肥大和肿瘤的发生发展的报道屡见不鲜,可见PABPC1与细胞的生长发育有密切联系.本文将主要介绍PABPC1的结构、表达调控、功能及其生物学作用.     

聚腺苷酸特异性核糖核酸酶(PARN)的功能多样性

聚腺苷酸尾的降解对于mRNA的质量控制和转录后基因调控十分重要. 在真核生物中,去腺苷酸化是mRNA降解和翻译沉默的首要限速步骤. 3′核糖核酸外切酶--聚腺苷酸特异性核糖核酸酶（poly(A)-specific ribonuclease,PARN）能够高效降解真核生物mRNA的聚腺苷酸尾. PARN不仅在降解mRNA poly(A)尾中发挥关键的作用,还参与DNA损伤、非编码RNA的加工成熟以及肿瘤等疾病过程. PARN是一种多功能酶分子,本文就PARN发现、结构、催化机制和功能多样性进行综述.     

利用线性表达框高通量表达人源单克隆抗体

目的:建立不通过克隆步骤高通量表达来源于人单个B细胞的抗体轻、重链基因的方法。方法和结果:PCR扩增3个末端重叠的DNA片段,即1CMV启动子和编码抗体引导区序列的片段;2抗体Ig G1重链恒定区序列和牛生长激素(BGH)poly(A)信号序列,轻链Igκ恒定区序列和BGH poly(A)信号序列,轻链Igλ恒定区序列和BGH poly(A)信号序列;以及3抗体基因可变区序列V_H、V_κ或V_λ。3个片段通过重叠延伸PCR构建全长线性片段即线性表达框,将此来源于人单个B细胞的配对的抗体轻、重链线性表达框共转染293E细胞,72 h收集上清检测到表达的抗体。结论:构建的抗体基因线性表达框是无须克隆,快速高通量表达抗体基因进行筛选分析的策略。     

用Tip column法分离纯化mRNA

鉴于大多数真核生物的mRNA具有3′端poly(A)的特征,目前,分离mRNA广泛采田oligo(dT)纤维素层析法。尽管这一方法成熟可行,但存在以下问题;流速较慢;柱床易发生堵塞;操作费时;洗脱体积较大。常需先沉淀浓缩后才能进行后续实验(如cDNA合成);在制备少量mRNA时,回收率较低等。据此,我们对mRNA分离方法作了改良,利用oligo(dT)纤维素吸附mRNA容量大的特点,尽可能缩小层析柱床     

枯草杆菌A_(17)中含Poly(A)的RNA的分离和体外翻译

在以甘油(0.24％)或谷氨酸(0.5％)作为碳源,低磷(6.4×10~(-5)M)合成培养基,37℃下生长15小时的枯草杆菌A_(17),细胞中的含有poly(A)的RNA,可被oligo(dT)-纤维素分离。在培养基中加入赤霉酸(GA_3)30 μg/ml的情况下,含poly(A)的 RNA(峰Ⅱ)约为上柱总RNA的0.16～1.27％,不加GA_3的则为0.16～0.45％。这种含poly(A)的RNA能在麦胚非细胞合成系统中刺激~3H-亮氨酸掺入蛋白质,可为对照的4～8倍,其放射比活性为7000～23000 cpm/μg RNA,说明这种含 poly(A)的 RNA具有mRNA活性。     

哺乳动物卵子与早期胚胎中全转录组poly(A)尾研究进展

在哺乳动物卵子向胚胎转变过程中，卵子和胚胎中的转录在合子基因组激活之前都是沉默的，因此m RNA转录后修饰在此过程发挥着重要的作用。poly(A)尾巴是影响mRNA命运和翻译效率的一种重要的转录后修饰。随着测序技术和分析工具的进步，尤其是三代测序技术的发展，poly(A)尾的长度和组成能够被精确测量，极大地拓展了人们对于poly(A)尾在哺乳动物早期胚胎发育过程中的认识。本文对poly(A)尾研究方法的发展及其在卵子向胚胎转变中的研究进展进行评述，以期为哺乳动物早期胚胎发育和不孕不育相关疾病的研究带来新的思路。     

大麦条纹花叶病毒(新疆株)中多聚腺苷酰核糖核酸含量、侵染活性及多聚腺苷酸链长分布的测定

1.用Oligo(dT)纤维素亲和层析将新疆大麦条纹花叶病毒(BSMV-XJ)RNA分为poly(A)~+(与Oligo(dT)纤维素结合的)RNA和poly(A)~-(不与Oligo(dT)纤维素结合的)RNA,其相对含量poly(A)~+RNA占75%,poly(A)~-RNA为25%。2.用~(32)P标记法测定了BSMV(XJ)RNA中3′端poly A的链长分布,结果poly(A)~+RNA带有数个至三十几个腺苷酸残基,而poly(A)~-RNA也含十个以下的腺苷酸残基。3.用系统感病寄主大麦进行侵染性试验表明,poly(A)~+RNA与poly(A)~-RNA对大麦具有同等水平的侵染性。4.文中讨论了Oligo(dT)纤维素的分离效果以及所用测定poly(A)链长分布方法的可靠性。     

竞争性RT-PCR法及对大肠杆菌acrA基因mRNA表达水平的定量研究

建立了用于检测大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922的acrA基因mRNA表达水平的定量竞争性RT-PCR(QC-RT-PCR)体系。PCR合成目标片段的突变型片段(321bp)作为内标准模板(Internal standard,IS),与目标片段一致的片段(389bp)作为目标模板(Target standard,TS),优化两种模板共扩增体系;梯度稀释IS与等量大肠杆菌cDNA样本共扩增,扫描电泳条带,软件分析数据。结果表明,引物设计合适,以IS和TS为模板实现共扩增,产物(321bp和389bp)通过1.5%琼脂糖凝胶电泳有效分离;梯度稀释IS与cDNA共扩增产物出现亮度梯度电泳条带;获得一元回归曲线y=-0.345 0.097x(相关系数r=0.959,标准差s=0.05997)。该研究成功构建内标准模板,优化的共扩增PCR体系实现了对大肠杆菌ATCC25922中acrA基因mRNA表达水平的检测,具有简便、高效、敏感度高等优点。     

核酶对人巨细胞病毒mRNA片段的体外切割

引导序列GSs(GuideSequences)是能与mRNA互补,引导核酶RNaseP催化核心M1RNA对互补区域特异切割的小片段游离RNA。针对人巨细胞病毒HCMV(humancytomegalovirus)DNA聚合酶mRNA序列设计GS,共价结合到大肠杆菌来源M1RNA中,构建成M1GST7核酶。通过对巨细胞病毒DNA聚合酶亚克隆片段转录产物体外切割实验,表明该核酶具备对DNA聚合酶mRNA片段的特异切割能力 。     

含尿激酶mRNA的人胚肾培养细胞的poly(A)+RNA的提取及鉴定

人胚肾原代培养细胞经换无血清培养液后4～6天,可产生较高的尿激酶活性,从2ml细胞沉淀中(2×10~5细胞)可提取60～100μgpoly(A)~+RNA。6M尿素酸性琼脂糖凝胶电泳表明,其大小为9S～28S,以此poly(A)~+RNA为模板可用于体外翻译及反转录实验,DNA-RNA点杂交表明,此poly(A)~+RNA含有编码尿激酶的mRNA,通过Northern blot杂交实验,估计mRNA大小在1～3 kb之间,本制品可供应反转录途径获得尿激酶基因之用。     

RNase P核酶对人巨细胞病毒UL54基因mRNA体外切割作用

外部引导序列(EGSs)是mRNA靶序列互补并引导RNaseP切割的小RNA片段。我们设计与人巨细胞病毒HCMV(Human Cytomegalovirus)UL54基因mRNA序列互补的EGSs,将其与大肠杆菌来源RNaseP催化核心M1RNA构建成M1GS核酶。通过对UL54基因亚克降片转录产物体外切割研究,证实该核酶具备对UL54 mRNA片段的特异切割能力,可以发展成为一种抗病毒试剂。     

鱼类抗冻蛋白的研究——Ⅱ.黄盖鲽抗冻蛋白基因cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

产于我国黄海的黄盖鲽(Pseudopleuronectes yokohamae)体内含有能阻止血液冰冻的抗冻肽(Antifreeze peptide AFP)。在对该蛋白进行纯化及对其特性的一系列研究的基础上,我们合成了一段抗冻肽基因的寡核苷酸片段。以此为引物,与黄盖鲽的mRNA进行杂交,从而特异性地反转录出抗冻肽基因cDNA片段。该片段经EcoRI Linker连接法克隆至大肠杆菌(E.coli)质粒载体pUC19上。抗冻肽cDNA插入片段经杂交证实后,对其进行了酶谱分析,核酸序列测定。重组克隆还在大肠杆菌JM83中得到了表达。