用Tip column法分离纯化mRNA

鉴于大多数真核生物的mRNA具有3′端poly(A)的特征,目前,分离mRNA广泛采田oligo(dT)纤维素层析法。尽管这一方法成熟可行,但存在以下问题;流速较慢;柱床易发生堵塞;操作费时;洗脱体积较大。常需先沉淀浓缩后才能进行后续实验(如cDNA合成);在制备少量mRNA时,回收率较低等。据此,我们对mRNA分离方法作了改良,利用oligo(dT)纤维素吸附mRNA容量大的特点,尽可能缩小层析柱床     

一种优化翻译起始效率的方法

本文以人分裂细胞核抗原(PCNA)基因作为目的基因,把包括PCNA基因5′端非翻译区(5′NTR)的24bp和编码38个氨基酸114 bp的顺序插入pTZ19R,构建与LacZ’5′端的融合基因。用寡核苷酸定点突变法在PCNA 5′NTR形成SD顺序,再用PCR法在SD顺序左右两侧分别随机突变6个和7个碱基,使它们与结构基因5′端顺序自发地形成各种可能的翻译起始区(TIR)二级结构。重组质粒转化JM109(DE3),以T7 RNA聚合酶-T7启动子调控转录。对288个重组子的β-gal活性测定表明,不同重组的表达量可相差55倍,其中9个表达量不同的重组子的RNA dot blot证实它们在转录水平无明显表达差异。由此提示,该研究策略和方法能有效地改变目的基因的TIR二级结构和捕获具有高翻译起始效率的表达克隆。     

非连续多核苷酸定点突变的方法

以人粒巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ-ＣＳＦ）、人α８干扰素（ｈＩＦＮ-α８）和分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）的ｃＤＮＡ定点突变为例,建立了一种新的大区域非连续多核苷酸同步定点突变的方法。经碱变性后的质粒ＤＮＡ,先用突变引物延伸单链,然后通过ＰＣＲ扩增得到突变双链ＤＮＡ。用该方法成功地改造了ｈＧＭ-ＣＳＦ基因５′端３６个核苷酸中的９个位点、ＩＦＮ-α８基因５′端３９个核苷酸中的９个位点和ＰＣＮＡ基因ＳＤ顺序两侧６个和７个核苷酸。与经典的含Ｕ单链寡核苷酸定点突变方法相比,本方法突变效率高,并省去了对突变克隆杂交筛选的操作     

囊尾蚴膜联蛋白32在大肠杆菌中的表达及纯化

在已获得的囊尾蚴膜联蛋白 (Annexin) 32cDNA的基础上 ,以PCR的方法在cDNA两端加上酶切位点 ,插入原核表达载体pJLA 5 0 3,热诱导表达后 ,外源蛋白大部分以可溶形式表达 ,表达量占菌体总蛋白的 35 %。经(NH₄)₂SO₄分级沉淀、DEAE阴离子交换层析及Sephacry1S 2 0 0凝胶过滤层析得到电泳单一条带 ,Westernblot及抗凝血实验证明表达产物是有生物活性的     

优化mRNA翻译起始区提高人粒－巨噬细胞集落刺激因子在E．coli中的表达

人粒－巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）是一种重要的造血生长因子．利用基因重组技术构建两个ｈＧＭ－ＣＳＦ的Ｅ．ｃｏｌｉ表达菌株,一个为在不改变氨基酸顺序的前提下,对ｍＲＮＡ翻译起始区核苷酸顺序进行优化突变（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｍ））,另一个为未突变的对照（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｎ））．经酶切电泳、ＤＮＡ测序、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ等分析鉴定,证明两者均能表达特异性的１４．６ｋＤｈＧＭ－ＣＳＦ,但ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｍ）的表达水平较ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｎ）提高了１．２６倍,占菌体总蛋白的１６．９％．ｍＲＮＡ翻译起始区二级结构预测分析表明,优化突变后生成自由能ΔＧ从原来的－１０．２提高至－９．４Ｋｃａｌ,ＡＵＧ从部分配对状态变为非配对状态．     

一种简单、快速、经济的mRNA分离方法

对oligo(dT)纤维素纯化poly(A)RNA的方法进行了改良.缩小了层析柱床的体积,使填料用量仅为常规量的1/50-1/100,即在移液器尖嘴中进行层析.与常规方法相比,它具有实验时间短、洗脱的mRNA可直接合成cDNA和得率较高等优点.     

DNA疫苗的研究进展与前景

十八世纪末,英国人琴纳(Jenner)创制了牛痘苗,用来预防天花,为预防医学开辟了广阔的途径。一百年后法国人巴斯德(Pasteur)研制炭疽、鸡霍乱和狂犬病疫苗获得成功,使人们意识到疫苗将在人及家畜的某些疾病防治方面起到其他手段所不能相比的作用。一种疫苗一旦研制成功,通过接种能调动和提高机体专一的免疫能力,起到有效的预防使用,使人或家畜免于致病。经过长期努力,已经有一批后来被称作传统疫苗的有效人用疫苗陆续被应用,如众所周知的牛痘、麻疹、脊髓灰质炎、伤寒副伤寒三联疫苗、白喉类毒素、百     

DNA疫苗的细菌内毒素检测

目的 :考察DNA疫苗细菌内毒素的检查方法的可行性及DNA疫苗的干扰作用。方法 :干扰试验和对比试验。结果 :供试品阴性对照系列样品溶液无干扰作用 ,与家兔法结果一致。结论 :将疫苗稀释 2倍可用灵敏度为 0 5EU ml的鲎试剂作细菌内毒素检查。     

猪γ干扰素基因的克隆、表达及其纯化

以RT-PCR方法,从经丝裂原诱导的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增出编码猪IFNγ的基因。经测序证实后插入载体pJLA503,并实现在大肠杆菌中的高表达。表达产物以包涵体形式存在,经7mol/L盐酸胍变性及精氨酸存在的情况下复性。再经DEAE-Sepharose离子交换柱、Sephdex-200凝胶过滤柱分离获得电泳单一纯猪IFN-γ蛋白,细胞病变抑制实验检测纯化产物有干扰素活性。     

mRNA翻译起始区构效关系的研究

本文分析了9个表达量相差55倍的5′PCNA-LacZ′重组子的TIR二级结构与翻译起始效率的关系。在5′NTR顺序确定为28个核苷酸(从转录起始位点起)时,TIR范围在约编码第12个密码子(第33至37核苷酸)处存在一个二级结构及其△G的变化阈位,在该阈位处按表达量调正重组子TIR的范围,得到△G与表达量之间相关系数为0.97的曲线;在TIR二级结构中,起始密码子处于配对的空间位置对翻译起始效率有明显抑制作用,但SD顺序的空间位置与表达量之间无明显相关性。