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通过构建高效表达载体,改进转染方法,与二氢叶酸还原酶(dhfr)基因共扩增等手段在CH0细胞内高效表达了人尿激酶原(Pr0-UK)cDNA。首先将pro—UK cDNA插入到sR α启动子的下游,构建成表达质粒pMGl0102,在cos-7细胞内进行暂时性表达,结果表明此启动子的表达水平比SV40早期启动子高约5倍。然后将质粒pMG10102和pSV2-dhfr线性化后用磅酸钙共沉淀法转染CH0-dhfr-细胞,经一系列筛选后获得20个能表达pro—UK的细胞克隆,纤维蛋白溶解平板法(FAPA)测定表达水平为12.5—100IU/106cells/d.再经MTX加压共扩增,得到9株高表达细胞系,其中最高的表达水平达到400—500Iu/10‘cells/d。2—3个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的。Western Blot分析证明细胞分泌的重组pro-UK具有与天然pro—UK相同的分子量,而且培养液中不加蛋白酶抑制剂时,分泌的重组UK大部分为单链(60%以上)。 相似文献
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重组痘苗病毒表达乙肝核心抗原基因的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
pMM2066质粒EcoR I酶切回收ATG前只有12bp的乙肝核心抗原基因片段,将此基因片段插入痘苗转移载体pGJP-5的P7.5启动子后,组建成P5-C2066质粒,通过细胞内同源重组技术,于BudR存在条件下用人TK-143细胞筛选出三株能表达HBcAg的重组痘苗病毒株。感染细胞上清液1:64稀释时仍能用ELISA法测到HBcAg活性,同时也能测到滴度相近的HBeAg活性。免疫电镜可见平均为26.6nm的HBcAg颗粒。进行了不同量的重组痘苗病毒感染不同细胞,和不同培养温度对HBcAg表达影响的观察。 相似文献
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利用DNA重组和细胞体内同源重组技术,分别获得了P7.5启动子和P11启动子单独带动的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的重组痘苗病毒和同一个重组痘苗病毒中含有P7.5和P11启动子分别带动一个HBsAg基因(正反两个插入方向)的四种重组痘苗病毒,比较了它们对HBsAg表达的影响。含P7.5启动子的比含P11启动子的重组痘苗病毒表达的HBsAg水平更高些;在同一个重组痘苗病毒中P7.5和P11两个启动子分别带动HBsAg基因时,两个启动子同向转录表达的HBsAg水平较低,而两个启动子又向转录时表达的HBsAg水平较高,但均没有单一P7.5启动子带动的HBsAg基因的表达水平高。 相似文献
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人尿激酶原全长cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达 总被引:8,自引:1,他引:7
通过磷酸钙共沉淀技术,将含有尿激酶原cDNA的表达载体(pSV2-PrUK)与含有二氢叶酸还原酶基因的表达质粒pSV2-dhfr-或MMTV—dhfr共转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株(CHO-dhfr-)。利用选择培养基选择出二氧叶酸还原酶基因表达阳性(dhfr+)的转化细胞灶。用溶解圈法测定尿激酶型纤溶酶原激活剂(u—PA)的生物活性,其中两株显著高于其他株细胞,命名为CLF-14和CLF-8,表达水平依次为24Iu/106细胞/48h,16Iu/106细胞/48h。用ELLSA测定CLF一14和cLF-8细胞上清,表现为强阳性,阳性值比阴性对照值(P/N)大于10,CLF-14和CLF-8细胞表达量分别为0.14-o.22μg/106细胞/48h和0.08-O.14μg/106细胞/48h。分泌产物能被抗尿激酶(UK)血清抑制,而不被抗组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的抗血清和正常兔血清抑制。 相似文献
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采用PCR重叠延伸法和基因重组技术构建了人尿激酶原cDNA序列中缺失150~156位氮基酸的突变体,以COS-7细胞中获得暂时性表达以及在CHO细胞中稳定高效表达,其表达水平为450~500IU/106cell/24h,表达产物经SDS-PAGE电转溶实验和westemblot分析证明,细胞分泌的Pro-UK突变体与天然Pro-UK以及完整全长DNA序列表达Pro-UK的分子量相同,为54kDa.绝大多数为单链,比完整cDNA序列表达产物的单链比例明显增高,与纤维蛋白的亲和性有所提高。 相似文献
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