神经元钙稳态失衡在阿尔茨海默病发病中的进展木

淀粉样蛋白的沉积与Tau蛋白磷酸化是阿尔茨海默病发病的关键分子机制,神经元胞内钙离子的变化可影响其生成和代谢;另一方面,这些蛋白的改变会进一步导致神经元钙稳态的失调,致使突触损伤、神经细胞凋亡及认知功能下降.本文就神经元钙稳态失衡在阿尔茨海默病发病中的进展进行综述.     

一种快速非同位素测定2',5'-寡聚腺苷酸合成酶活性的方法

介绍一种新的非同位素测定２′,５′－寡聚腺苷酸合成酶（２′,５′－ＯＡＳＥ）活性的方法．反应液经已糖激酶处理,点样于ＰＥＩ－纤维素薄层层析板上,经甲醇浸泡与预层析和在０．７５ｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．５）缓冲液中的层析可使ＡＤＰ和２′,５′－Ａｎ分离开,系统偏差和２′,５′－ＯＡＳＥ测活分析表明,本方法可用于粗酶液及部分纯化酶液的２′,５′－ＯＡＳＥ活性测定,并可用于临床生化分析     

黑曲霉3.795glaA基因及其5'调控区的克隆和序列分析

黑曲霉Ｔ２１是由黑曲霉３．７９５经诱变育种获得的糖化酶高产菌株,为阐明其高产的分子机制,由黑曲霉３．７９５克隆了糖化酶结构基因及其５′旁侧序列,并与黑曲霉Ｔ２１的相应序列进行了比较．由黑曲霉３．７９５菌丝体分离染色体ＤＮＡ,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明,糖化酶结构基因位于～２．５ｋｂ的ＥｃｏＲⅠ－ＥｃｏＲⅤ染色体ＤＮＡ片段上,在此ＥｃｏＲⅠ位点上游约１．０ｋｂ处有一ＳａｌⅠ位点．为构建糖化酶结构基因及其５′旁侧序列的基因组文库,该染色体ＤＮＡ分别用ＥｃｏＲⅠ＋ＥｃｏＲⅤ和ＥｃｏＲ＋ＳａｌⅠ消化,琼脂糖凝胶电泳分离并回收长度在１．０ｋｂ左右和２．５ｋｂ左右的ＤＮＡ片段,分别与ｐＵＣ１９载体连接后转化入Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５．用原位杂交方法筛选到了携带糖化酶基因编码区及其１５０５ｂｐ５′旁侧序列的阳性克隆．对克隆片段的ＤＮＡ序列进行了测定并与黑曲霉Ｔ２１的相应序列进行了比较,结果表明,在糖化酶基因编码区及其１５０ｂｐ３′非编码区内,未发现碱基差异,但在－３４０～－１５０５的５′上游区内发生了９个位置的碱基变化,包括缺失、插入和替换．这些结果表明,黑曲霉Ｔ２１与３．７９５的糖化酶产量的差异与其结构基因无关,但可能与其     

水解淀粉的酿酒酵母菌的构建

把黑曲霉糖化酶cDNA,酵母磷酸甘油激酶基因启动子区和终止区以及酵母Ty因子的δ序列构建成整合型的糖化酶表达分泌质粒pKG 1。该质粒转化酿酒酵母Y33得到整合型转化子。转化子分泌糖化酶活力在3.0μ/ml以上,在以5％可溶性淀粉为碳源的培养基中静止培养7d,淀粉利用率达86％,生成酒精的浓度与以5％葡萄糖为碳源时相等。     

黑曲霉糖化酶高产和低产菌株糖化酶基因调控区的克隆及其分析比较

以PCR合成的糖化酶高产菌株黑曲霉(Asp. Niger)T21糖化酶基因5’近端非编码区588bp(EcoRI-BamHI)的序列为探针,从T21染色体DNA中克隆到近2.0kb的糖化酶基因5’端非编码区序列,并以此序列为探针从糖化酶低产菌株黑曲霉3.795(T21的诱变出发株)的染色体DNA中克隆到1.5kb的糖化酶基因5’端非编码区序列。该二序列的分析测定结果表明,其结构特征与文献报道的黑曲霉糖化酶基因5’端非编码区的基本一致,被称为“核心启动子”(Core promoter)的TATAAAT框及GCAAT框,分别在翻译起始点的-109bp及-178bp处。此外,在曲霉amdS,amyB基因中已发现有调控功能的CCAAT序列存在于-449bp和-799bp处。高产和低产菌株糖化酶基因5’端非编码区序列的分析比较结果表明,有9个部位的碱基发生了变化。此实验结果为进一步研究黑曲霉糖化酶基因在转录水平上的调控规律打下了基础。     

固定化多核苷酸磷酸化酶的研究——Ⅱ.用固定化酶制备Poly I和Poly C

固定化PNP酶柱反应器在pH9,37℃,含有6微克分子/毫升MgCl_2,0.04%NaN_3,11～12微克分子/毫升CDP(IDP)的条件下,连续聚合反应1.5～2个月,转化率基本不变。所得的Poly I,Poly C用Lowry法测不出蛋白,紫外吸收光谱符合标准。按人体用量放大350～400倍进行急性动物毒性试验证明无毒害作用。可以省去自然酶制备Poly I,Poly C过程中酚脱蛋白的工艺。     

凝乳酶原(凝乳酶)二硫键Cys206-Cys210的定位突变

在对凝乳酶原二硫键Cys206\|Cys210进行定位突变过程中发现,在相应的模板序列中有自身形成自由能为-16.1kcal/mol的茎环结构倾向,妨碍与引物结合,从而难以合成突变的DNA,采用快退火可解决此矛盾。5个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达,除C206A外,约占细胞总蛋白的50%左右。突变体的复性结果表明,Cys206\|Cys210对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的,但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响,在5个突变体中,C206A/C210A的复性率分别为C206S/C210S\,C210A\,C210S的4.5倍、20倍和30倍,而C206A完全不能复性。C206A/C210A与C206S/C210S的远紫外CD光谱与野生型基本相同,其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变,而荧光强度有显著增加。由于上述3个蛋白具有相同比活,说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象,而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰。     

固定化多核苷酸磷酸化酶的研究——Ⅰ.固定化多核苷酸磷酸化酶的制备及其基本性质

对-重氮基苯磺酰乙基琼脂糖是制备固定化多核苷酸磷酸化酶的较好材料,与具有同样活性基团的纤维素和葡聚糖凝胶G200相比,活力回收高、稳定性好。固定化酶的最适pH 向偏碱的方向转移,最适温度较自然酶为宽,表观米氏常数与自然酶基本一致。57℃保温30分钟尚保留70%以上的活力,而自然酶仅剩余22%的活力,说明稳定性有所提高。     

固定化多核苷酸磷酸化酶的研究——Ⅰ.固定化多核苷酸磷酸化酶的制备及其基本性质

对-重氮基苯磺酰乙基琼脂糖是制备固定化多核苷酸磷酸化酶的较好材料,与具有同样活性基团的纤维素和葡聚糖凝胶G200相比,活力回收高、稳定性好。固定化酶的最适pH向偏碱的方向转移,最适温度较自然酶为宽,表观米氏常数与自然酶基本一致。57℃保温30分钟尚保留70%以上的活力,而自然酶仅剩余22%的活力,说明稳定性有所提高。     

黑曲霉糖化酶高产菌株的糖化酶结构基因的分离及其序列分析

从糖化酶高产菌株(Aspergills niger)T21中分离出染色体DNA.Southern印跡分析表明糖化酶结构基因位于约2.5kb的EcoRⅠ-EcoRV片段中.该染色体DNA经EcorⅠ、EcoRⅤ完全酶切后,用琼脂糖凝胶电泳分离,回收2.0—3.0kb的片段,与载体pBR322连接后转化宿主菌大肠杆菌DH5,获得转化子.通过原位杂交,从转化子中筛选出4个阳性克隆.阳性克隆的进一步酶切鉴定及序列分析表明,黑曲霉T21糖化酶结构基因大小为2.3kb,含有4个内含子.