DNA测序中常见影响因素的研究

对测序中的模板、引物、测序反应条件及测序反应纯化方法和仪器操作等进行研究。结果显示测序模板的纯度影响测序的质量 ,浓度对测序的长度有影响。引物设计时除符合一般设计原则外 ,Tm值最好在5 0℃～ 6 0℃之间 ,且无成串的G、C。改变变性、退火、延伸的时间和温度对特殊DNA模板的序列测定有较好的效果。测序反应产物的纯化有几种方法 ,以 70 %乙醇沉淀法最经济、方便。因此模板的纯度和浓度对测序成功与否起决定作用。最佳反应条件可降低成本 ,提高测序成功率 ,乙醇沉淀法是首选的测序反应产物纯化方法。仪器操作熟练、正确与否也会影响测序结果。     

应用RD-PCR技术制备HIV基因芯片探针

利用限制性显示 (RD PCR)技术快速分离HIV 1基因片段制备DNA芯片探针 .以Sau3AⅠ酶切HIV基因 ,得到许多大小适合芯片的限制性酶切片段 .然后在片段两端接上接头 ,根据酶切位点、接头的序列设计通用引物 .在该通用引物的 3′端分别延伸一个碱基后 ,通过引物间的两两组合 ,将PCR反应分成 10个亚组 .纯化各组PCR产物 ,克隆到T载体上 .阳性克隆经鉴定、扩大培养后提取质粒 .以质粒为模板扩增靶片段并进行序列分析 .每个亚型得到了十几个 10 0～ 10 0 0bp的HIV基因片段 .研究表明 ,RD PCR技术是一种有效的快速制备基因芯片探针的方法     

用限制性cDNA文库制作K562细胞基因表达谱芯片探针

以人红白血病K562细胞为材料,应用限制性显示PCR（RD-PCR）技术构建cDNA文库,该文库通过PCR引物3′端延伸两个不同碱基形成136对引物对cDNA进行限制性扩增,得到136组不同的PCR扩增产物,纯化后与载体连接并转化细菌,即为限制性cDNA文库,根据不同的分组进行克隆的鉴定和分离。并进行大量扩增制备cDNA芯片探针,该方法构建的文库因经过了限制性分组扩增,每组均含有特定的cDNA,因而大大加快了随后克隆的分离 和鉴定的速度,为基因芯片探针制备提供了一个新方法。     

芯片杂交中荧光标记样品定量与非定量的比较研究

比较在芯片杂交中,荧光标记样品定量与非定量对杂交结果的影响。其方法是,提取经As2O3作用K562细胞前后的总RNA,逆转录成cDNA第一链,并分别用Cy3／Cy5标记。标记后的样品再次定量或不定量,但均取相同体积上样与K562芯片杂交,用扫描仪扫描并分析。其结果,标记后样品定量与不定量杂交的结果都与理论推测一致,但以样品定量进行杂交的效果更好,标记样品杂交前再次定量的,分析发现2个基因表达下调;杂交前不定量仅取相同体积进行杂交的,发现6个基因片段表达下调,其中只有2个基因与细胞凋亡通路密切相关。认为在芯片的杂交检测中,对荧光标记样品杂交前再次定量可大大提高杂交结果的可靠性。     

大肠杆菌poly(A)化mRNA基因的芯片制备*

利用大肠杆菌mRNA中存在的一定程度的poly (A)现象 ,利用oligo (dT)与poly(A)特异结合的特性 ,纯化并逆转录mRNA ,并应用RD PCR方法获得了 1 70多条大肠杆菌poly (A)化mRNA的基因片段 ,利用这些片段打印成基因芯片 ,以供后续大肠杆菌的基因表达研究。     

应用限制性显示PCR技术构建细菌poly(A)化mRNA的cDNA文库

针对细菌mRNA poly(A)化位点的高度多态性,利用oligo(dT)与poly(A)特异结合的特性,以oligo(dT)一纤维素纯化mRNA,并以oligo(dT)18为引物逆转录合成cDNA,用限制性内切酶消化cDNA,所得的限制性内切酶片段与通用接头相连,通过10个选择性引物组合进行选择性PCR,使各片段得以扩增并分布于10个亚组中,并进行克隆,成功地克隆了100多个基因片段,已对其中40个进行了测序分析,探讨了限制性显示PCR技术在细菌poly(A)化mRNA cDNA库构建中的应用价值。     

应用ABI PRISMTM310测序仪进行快速且经济的DNA测序

目的 使DNA测序更快速且经济。方法 根据测序模板的不同采取相应的测序方法。视具体情况调整测序反应条件,改进仪器的操作方法,减少测序反应体系及合理使用试剂,结果 对测序模板,测序条件和仪器操作的优化,可缩短测序时间,充分利用试剂,可降低测序成本。结论 在保证测序质量的前提下,不仅快速而且经济。     

纯化探针降低基因芯片杂交结果的背景

研究探针的纯化对基因芯片杂交结果的影响。将乙醇沉淀的探针和用DNA纯化试剂盒纯化的探针分别与基因芯片交,在同等条件下进行杂交后清洗和芯片扫描检测。结果表明,纯化的探针与基因芯片杂交结果的背景低,而未纯化的探针背景强,阳性信号界限比较模糊。运用基因芯片进行基因表达谱研究,要求杂交检测的结果必须低背景。探针的纯化是影响芯片杂交结果的一个重要因素。     

应用RD-PCR技术制备基因芯片靶基因片段

应用RD－PCR技术分离SH－SY5Y细胞的基因片段。从正常培养的SH－SY5Y细胞中提取总RNA,经oligo(dT）纤维素柱纯化分离出mRNA,然后以oligo(dT18)为锚定引物反转录生成单链cDNA,再以此为模板合成DNA的第二条链;将双链DNA经Sau3AI酶切之后,接上接头,经通用引物和选择性引物进行扩增;然后与载体pMD18-T相连,克隆鉴定、筛选、测序。所分离的cDNA片段经过扩增后用于制备基因芯片的靶基因,杂交检测的结果表明,此种方法所分离的基因片段可以用于基因芯片的靶基因片段,所制备的芯片将为进一步研究神经细胞基因表达提供了条件。     

自杀基因治疗的作用机制及其应用

自杀基因治疗已逐渐成为肿瘤等疾病基因的治疗中的一种重要方法,本文介绍了ＴＫ,ＣＤ等几种常见的自杀基因,并概述了自杀基因治疗中的旁观者效应,基因转移系统靶向性研究及自杀基因治疗在肿瘤,骨髓移植,心血管疾病等领域中的应用。