肝素酶基因可变剪接体的克隆及鉴定

目的:克隆肝素酶基因的可变剪接体并测序。方法:根据人肝素酶的cDNA序列设计引物,用RT-PCR方法从正常人外周血白细胞中扩增肝素酶基因的可变剪接体,构建至pGEM-T Easy载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆并进行序列测定。结果:获得了肝素酶基因的3种可变剪接体形式,即5号外显子缺失可变剪接体、6号外显子缺失可变剪接体、5和6号外显子缺失可变剪接体,其中后2种可变剪接体尚未报道。结论:克隆了肝素酶基因的3种可变剪接体,有助于研究各种肝素酶可变剪接体编码蛋白的结构和功能及其在肿瘤发生转移过程中的作用。     

鉴定9个新的RHD基因mRNA可变剪接体

为了研究各种RHD基因mRNA可变剪接体的基因结构, 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测正常人脐血样本RHD mRNA, 对RHD cDNA进行TA克隆和序列分析, 对各可变剪接体的剪接位点进行DNA序列分析, 并将RHD mRNA进行表达序列标签(ESTs)分析。结果在28个阳性克隆中, 除全长RHD cDNA外, 共检测到12种(包括9种新的)RHD可变剪接体, 发现外显子遗漏、5′和3′剪接位点变异3种剪接形式, 涉及外显子2~9, 其中6种新的剪接体同时存在RHD和RHCE基因同源杂交现象。ESTs分析还检索到内含子保留形式的剪接体。研究表明, RHD基因mRNA存在复杂的可变剪接机制, 除已报道的剪接体外, 检测到9种新的RHD可变剪接体, 并发现了可变剪接和同源杂交并存现象。     

大鼠Mocs2基因跳跃型外显子可变剪接保留率的检测

可变剪接是真核生物基因表达调控的一种重要方式,它通过剪接位点调控ORFs (Open reading frames)区域外显子或内含子的表达,产生不同的mRNA剪接体,进一步翻译成具有相同或不同功能的蛋白质,从而对诸如发育、疾病、环境响应等生物学过程产生重要影响.已有文献报道,人类Mocs2基因exon 1a与exon 1b外显子发生互斥型可变剪接,产生的两个剪接体分别编码钼喋呤合酶的大小亚基,参与钼辅因子生物的合成过程.基于本课题组前期大鼠肺部组织RNA-seq测序的结果,发现Mocs2基因2号外显子转录后可被剪接或保留,产生两个不同的剪接体.为验证测序结果的准确性,本研究利用半定量PCR与实时荧光定量PCR两种方法检测大鼠脑、海马、肺组织中Mocs2基因2号外显子的保留率.半定量PCR方法检测大鼠肺、海马、大脑组织中Mocs2基因的保留率分别为(88.28±3.09)％、(99.44±0.24)％、(99.54±0.19)％.实时荧光定量PCR检测的保留率分别为(66.76±20.47)％、(75.60±12.44)％、(87.28±16.4)％.实验结果表明,Mocs2基因2号外显子在大鼠中存在可变剪接现象,且不同组织具有一定差异.本工作进一步验证了两种PCR方法检测前体mRNA可变剪接保留率的可行性.     

定位于1p36.12～1p35.1 的良性家族性婴儿惊厥家系 8 个候选基因的排除克隆*

目的:克隆定位于1p36.12～1p35.1上微卫星标志D1S2864和D1S2830之间12.4cM的区间内的腓骨肌萎缩症2L型的致病基因。方法:应用生物信息学方法筛选8个候选基因(NHE1、SMN、STX12、OX1R、BDR2、DHHC18、FLJ10315和SESN2),设计合成扩增8个基因外显子及外显子与内含子交界的引物,DNA直接测序法进行序列变异分析。结果:未发现与BFIS共分离的致病突变,但发现3个已知的多态。结论:排除了8个候选基因为该BFIS致病基因的可能。     

CRISPR/Cas9系统介导敲除CSN2基因奶山羊胎儿成纤维突变细胞的制备

旨在研究β-酪蛋白(β-casein,CSN2)对奶山羊泌乳性能的影响,利用CRISPR/Cas9系统敲除奶山羊胎儿成纤维细胞(GFFs)CSN2基因,为转基因动物模型构建提供核供体。针对CSN2第二号、八号外显子设计5个靶向CSN2基因sg RNA(T1、T2、T3、E1和E2),与PX330-e GFP载体连接,构建PX330-e GFP-sg RNA敲除表达载体,经T7E I酶切实验评估敲除效率;选择第八号外显子敲除效率最高sg RNA,构建PX330-Neo-sg RNA敲除载体,将PX330-e GFP-sg RNA T及PX330-e GFP-sgRNAE与PX330-Neo-sgRNAE组合转染细胞,经流式分选、G418药筛获得敲除CSN2基因细胞。Western blot测定转染细胞CSN2表达情况。测序结果表明各sgRNA均正确连入PX330表达载体中,T7E 1酶切实验表明sg RNA T1、sgRNAE2敲除效率最高达34.9%和25.9%;经荧光定量PCR及免疫荧光检测结果表明,eGFP+Neo转染组CSN2敲除细胞比例显著高于e GFP+e GFP转染组(P0.05)。综上表明,CRISPR/Cas9系统可有效应用于奶山羊胎儿成纤维细胞基因编辑,产生的突变细胞为制备CSN2基因敲除奶山羊提供核供体材料。     

草菇exo-β-1,3-葡聚糖酶基因可变剪接体的克隆与表达分析

可变剪接是基因表达调控的一种重要方式。本研究利用RT-PCR克隆鉴定到草菇exo-β-1,3-葡聚糖酶基因(exg2)的4种可变剪接体(exg2V1,exg2V2,exg2V3和exg2V4),其中,exg2V1第7个内含子保留;exg2V2第11个内含子保留同时剪切掉第12个外显子的后58bp;exg2V3同时保留第7个和第17个内含子;exg2V4同时保留第2、第9和第17个内含子。4种剪接体均在可变剪接位点提前出现终止密码子,导致预测编码的氨基酸序列中包含不完整的结构域。定量PCR结果显示:草菇5个发育时期中,4种可变剪接体表达量均比标准剪接体exg2低,但4种可变剪接体的表达也表现出一定的时期和组织差异性。初步推断发现的草菇exg2基因4种可变剪接体均为无义介导的mRNA降解,通过此方式达到对exg2基因标准剪接转录本的精准调控。     

牛α—s1酪蛋白基因5’端及上游区的克隆鉴定和部分序列分析

本文以PcR法克隆得到牛α—s1酪蛋白基因5’端800bp片段,并以该片段为探针,筛选了以EMBL3为载体构建的牛基因组文库,得到一个阳性克隆。酶切该克隆,并以牛α—s1酪蛋白基因5’端800bp片段及该基因cDNA为探针杂交,鉴定了该插人片段的方向,亚克隆了各相应酶切片段,制作了较为详细的限制酶图谱,并分析了该基因转录起始点前后部分序列。与该基因现有的资料比较,酶切图谱存在部分位点的差异,序列存在少量突变和缺失,在5’上游区均发现有内含子及外显子部分,且缺失均发生于有重复序列的部位。     

人癌胚抗原单链抗体基因的构建和筛选

从分泌抗癌胚抗原(carcinoembryoni antigen, CEA)单抗的杂交瘤细胞株C50中提取总RNA, 逆转录成cDNA, PCR扩增分别得到抗体轻、重链可变区基因, 再利用两对PCR引物合成和扩增得到全单链抗体基因. 将含轻、重链可变区序列的DNA片段克隆于含噬菌体基因Ⅲ的噬菌粒pCANTAB5. 重组克隆在噬菌体表面表达基因Ⅲ与单链抗体的融合蛋白. 表达具抗原结合活性的单链抗体的重组噬菌体可以通过亲和筛选的方法筛选得到并富集. 利用该方法我们可以从许多分泌不同抗体的杂交瘤细胞RNA中快速克隆和筛选功能性抗体可变区基因.     

牛α—s1酪蛋白基因3’端的克隆鉴定及序列分析

文用牛α—sl酪蛋白基因cDNA为探针,筛选了以EMBL3为载体构建的牛基因组文库2×10 5pfu,得到一个阳性克隆。分别以牛α—sl酪蛋白基因cDNA全长、终止符前后序列为探针鉴定了该克隆,制作了较为详细的限制酶谱,亚克隆了相应片段,并对含有终止符和poly A加成信号的有关亚克隆进行了序列分析,结果表明：该克隆含有牛α—sl酪蛋白基因终止符下游3．5kb及上游10．2kb片段,与现有的该基因的资料相比较,限制酶谱存在部分差异,DNA序列有多处点突变,并有少量缺失。点突变在内含子和外显子均有发生,这是限制酶图谱差异的原因。     

山羊与牛乳腺差异表达基因的筛选及半定量RT-PCR分析

山羊和奶牛具有非常相似的泌乳过程,但在产乳量和乳成分(脂肪和蛋白含量)之间存在很大的差异,而且山羊奶还具有特殊的膻味。本研究根据山羊和牛在基因编码序列上具有非常高的保守性原理,利用抑制消减杂交技术对3只西农萨能奶山羊和3头荷斯坦奶牛泌乳末期的乳腺组织进行差异表达基因分析。分别提取山羊和牛乳腺组织总RNA,分离mRNA并合成cDNA,以山羊乳腺组织cDNA作为测试,牛的乳腺组织cDNA作为对照。cDNA经RsaⅠ酶切后将测试组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次PCR反应,产物与T/A克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增。随机挑选克隆经PCR鉴定发现有150个克隆具有200bp-1000bp插入片段,挑选50个差异片段不等的克隆进行测序及同源性分析,结果得到5个已知乳蛋白(αs2酪蛋白、β酪蛋白、К酪蛋白、α乳清白蛋白和β乳球蛋白)基因的编码序列和6个新的EST序列,EST序列已登录GenBank,登录号分别为EG588067、EG588068、EG588069、EG588070、EG588071和EG588072。通过半定量RT-PCR分析,发现β酪蛋白基因mRNA表达量在山羊乳腺中显著高于其在牛乳腺中的表达量,К酪蛋白在乳腺中的mRNA含量与其所表达的蛋白质在乳中含量存在很大差异,表明К酪蛋白虽然和其他酪蛋白具有相同的调控机制,但其在分泌和运输机制上与其他酪蛋白不同。     

连续3步基因抓捕构建牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座

目的:构建一个利用牛αS1酪蛋白基因座完整的上下游调控序列指导人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)基因组序列在乳腺特异性高效表达的牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座。方法:采用连续3步基因抓捕的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先无痕连接在一起的6个同源臂,构成能连续进行3次基因抓捕的抓捕载体;然后,在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术,第一步从含牛αS1酪蛋白基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆9 kb的牛αS1酪蛋白基因3'端侧翼序列到抓捕载体上,第二步从人tPA BAC上亚克隆17 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TGA)的人tPA基因组序列,第三步从牛αS1酪蛋白BAC上亚克隆20 kb的牛αS1酪蛋白基因5'端完整侧翼序列,并使这3个基因片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起,形成一个长约46kb的牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座。结果:经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,构建的杂合基因座中,原牛αS1酪蛋白基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被人tPA基因组序列精确置换。结论:连续三步基因抓捕构建杂合基因座乳腺表达载体的技术,为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供了探索性研究。     

山羊β酪蛋白基因克隆及序列分析

用LongPCR技术克隆山羊 β酪蛋白 (CSN2 )全基因 13.7kb的序列 (GenBank登录号 :AF4 0 90 96 ) .利用PCR RFLP方法鉴定第 14和 192位氨基酸残基相应的核苷酸序列中出现的 2个多态性位点 ,其中第 192位氨基酸残基处的TspRⅠ位点是Saanen奶山羊CSN2基因中新发现的 1个多态性位点 .生物信息学方法分析山羊CSN2基因可见 ,非编码区中的SINE和LINE序列内含多种乳蛋白基因表达调控元件 ,对其基因的顺式表达和转录后调控可能具有重要的作用     

河南HIV感染者的HIV-1B型株tat基因的克隆及序列分析

克隆河南人免疫缺陷病毒(HIV)感染HIV-1B型株tat基因完整编码框序列,并分析比较其编码产物的序列结构特点。使用重叠PCR技术,从河南省1名HIV-1感染外周血标本中扩增出to／基因第一和第二外显子并重组为完整的tat基因序列。获得的HIV-1B病毒株tat基因,第一外显子为263bp,第二外显子为214bp。将该基因编码产物与其他HW-1株Tat蛋白经DNA软件编辑并翻译成蛋白质,使用Clustal X1．81进行多序列对比分析发现,第一外显子编码产物的3个保守区域的氨基酸组成大致相同,只有少数氨基酸存在差异。由于Tat蛋白不同病毒株间有高度保守的Cys富集区、核心区和碱性氨基酸富集区,tat基因的克隆为研究其功能并以其为靶点设计和筛选抗艾滋病的药物奠定了基础。     

利用RT-PCR技术验证基于小鼠外显子芯片发现的缺血相关基因的表达

目的:利用RT-PCR技术验证并确认基于小鼠外显子芯片发现的部分缺血相关基因的表达,以鉴定候选基因的外显子是否发生可变剪接,从而实现对外显子芯片结果的鉴定。方法:根据生物信息学分析结果,选取小鼠外显子芯片中的3个基因(Ube3c,6330439K17Rik,Atp7a),在预测发生可变剪接的外显子两侧设计上下游引物,PCR后进行凝胶回收,再克隆到载体中进行测序。结果:RT-PCR及测序结果表明,Ube3c基因在6号外显子、6330439K17Rik基因在12号外显子、Atp7a基因在3号外显子发生可变剪接,与芯片预测结果一致。结论:RT-PCR技术可针对外显子芯片的结果进行可靠性验证,为可变剪接基因表达研究提供了一种有效手段。     

西农萨能奶山羊β-酪蛋白基因启动子区的克隆、生物信息学分析及活性研究

根据已发表的β-酪蛋白基因全序列设计合成引物,以西农萨能奶山羊乳腺组织基因组DNA为模板,通过长链PCR扩增β酪蛋白基因组基因5’侧序列。将该序列克隆入pMD18-T载体,并对其进行序列测定。结果克隆得到西农萨能奶山羊β-酪蛋白基因-4 359至＋2 106共6465bp序列。该序列保留β-酪蛋白第一内含子、第一外显子和第二外显子及其信号肽部分。将该序列与已公布的其他山羊β-酪蛋白基因序列进行比较,其同源性为96％-98％。生物信息学分析显示,β-酪蛋白基因启动子区包含有TATA启动子序列和HOXF、Oct-1、AP1、CEBP、STAT、NFKB、GR、ER、PR和ETS等转录因子识别位点。将此6 465bp片段插入荧光素酶报道基因载体pGL3-Basic中,构建重组质粒pGL3／B65,瞬时转染萨能奶山羊原代培养的乳腺上皮细胞48h后检测显示,该假设的启动子区确有启动子功能,对泌乳激素发生反应。本研究为进一步构建有效的乳腺生物反应器载体奠定了基础。     

定位于5q31-5q32的DFNA52的20个候选基因的突变筛查

为了克隆定位于5号染色体微卫星标记D5S2056和D5S638之间约8.8 cM的区间内的非综合征性常染色体显性遗传性耳聋 DFNA52 (OMIM: 607683)的致病基因, 文章根据基因在耳蜗组织的表达情况, 筛选出20个候选基因, 设计合成了扩增20个基因外显子及外显子与内含子交界的引物, 用DNA直接测序法进行序列变异分析。结果显示, 在基因外显子及侧翼区共发现了45个单核苷酸多态, 其中42个变异在多态数据库已报道, 其余3个为新发现的单核苷酸多态, 序列变异与疾病表型无共分离现象, 排除了这些基因外显子突变导致遗传性耳聋的可能性。     

人t-PA突变体cDNA打靶敲入小鼠ES细胞β-酪蛋白位点的研究

应用克隆的基因组序列作为同源臂 ,构建了小鼠 β 酪蛋白基因定位敲入打靶载体。短臂长 2 7kb ,包括小鼠 β 酪蛋白基因 5′端侧翼区、第 1外显子、第 1内含子、部分第 2外显子。长臂包括小鼠 β 酪蛋白基因部分第 2内含子、第 3～ 7外显子、第 3～ 6内含子、部分第 7内含子 ,长 3 4kb。人t PA突变体cDNA在第 2外显子中与小鼠 β 酪蛋白信号肽序列融合。正筛选标记neo放置在 β 酪蛋白基因第 2内含子中部 ,负筛选标记tk位于短臂外侧。ES细胞株TC 1在滋养层上培养扩增。处理ES细胞使其密度达到 2× 10 7个 /mL后 ,将 4 5 μg线性化的打靶载体DNA与 1mL细胞混匀后电击。转染的细胞在含G4 18和Gancyclovir的选择培养基中培养 ,7d后挑取 192个抗性克隆 ,扩增、提取基因组DNA ,EcoRⅠ酶切后 ,用打靶载体 5′端内侧探针进行Southern杂交 ,野生型出现 9 8kb ,而中靶的 β 酪蛋白基因由于敲入的人t PA突变体携带一个EcoRⅠ位点 ,中靶等位基因出现 6 6kb。从 78株ES细胞株中获得 1株发生正确同源重组的中靶ES细胞。     

Nav1.5/SCN5A基因新的变构体编码人脑组织Nav1.5 Na+通道

河豚毒-抵抗性(TTX-R)Nav1.5 Na 通道是心肌的特异性Na 通道,虽然研究发现神经元中也存在河豚毒-抵抗性Na 电流及Nav1.5/SCN5A mRNA的表达,但其确切的cDNA序列尚不清楚.采用RT-PCR法对人脑组织Nav1.5/SCN5A基因cDNA进行克隆发现:人脑组织Nav1.5/SCN5A基因cDNA有2种变构体,hB1和hB2(accession number EF629346,EF629347),其中hB1全长6201个碱基,其开放读码框架(ORF)参与编码2016个氨基酸,和人心肌Nav1.5 Na 通道氨基酸序列相同率高达98%,共有28个不同的氨基酸,其中7个集中位于第6A外显子与第6外显子编码区.与人心肌Nav1.5/SCN5A基因cDNA不同的是,在对人脑组织Nav1.5/SCN5A基因cDNA的克隆中未发现该基因第18外显子的选择性剪接,但却发现其第24外显子的选择性剪接,2种选择性剪接体(hB1和hB2)在脑组织中基本同时表达,表达比率接近1∶1,但在心脏中二者的表达比率却与年龄有关.人Nav1.5/SCN5A基因的第24外显子定位于染色体3P21区,共有54个碱基,参与编码18个氨基酸.RT-PCR法证实第24外显子的选择性剪接也可发生在大鼠心脑之外的其他组织中,竞争性PCR法证明,不同组织中2种选择性剪接体的表达比率不同,且随着周龄的增加,2种选择性剪接体在各组织中表达的变化趋势不同.此外,RT-PCR法还发现Wistar大鼠全身16种组织中均可检测到Nav1.5/SCN5A mRNA的表达.上述实验结果说明,Nav1.5 Na 通道在全身组织中分布广泛,但编码人脑组织Nav1.5 Na 通道与心肌组织该离子通道的cDNA序列不同,是Nav1.5/SCN5A基因的2种变构体,这为深入研究不同组织中Nav1.5 Na 通道的功能提供了基础.     

小鼠XBP1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及筛选

目的:构建小鼠XBP1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体,筛选具有较好干扰效率的小鼠XBP1 siRNA靶序列.方法:针对小鼠XBP1基因特异性序列,设计4个RNAi靶序列及1个阴性对照序列,合成含有正义和反义Oligo DNA的互补DNA序列,退火形成双链DNA,并克隆到经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,DNA测序鉴定.由病毒包装系统进行包装,经滴度测定后感染NIH3T3细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率.结果:PCR鉴定与DNA测序证实合成的寡核苷酸链插入正确,293T细胞测定病毒滴度为1×108TU/ml.Real-timePCR证实XBP1-siRNA-3靶点的干扰效率最高,其干扰效率达到95%以上.结论:成功构建并筛选了小鼠XBP1基因RNAi慢病毒载体,为研究XBP1在巨噬细胞免疫功能调控中的作用奠定了基础.     

蓝舌病毒血清5型毒株S7基因编码区的分子克隆与序列分析

目的:对蓝舌病毒(BTV)血清5型毒株(BTV-5)的S7基因编码区(ORF)进行克隆和序列分析。方法:用TRIzol LS试剂提取病毒总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增BTV-5型毒株S7基因的编码区,将扩增片段克隆到pGEM-T Easy载体上,对阳性克隆进行核苷酸序列测定;采用DNAStar和DNASIS v2.5软件对环状病毒属不同种群的S7基因ORF序列及其推导的氨基酸序列进行同源性及系统进化树分析。结果:克隆的基因片段长1050bp,为S7基因开放性读码框的全长序列,编码349个氨基酸残基;与环状病毒属不同血清型毒株比较,核酸序列同源性范围为42.2%～96.6%,推导的氨基酸序列同源性范围为40.4%～99.7%。结论:蓝舌病毒与非洲马瘟病毒、鹿流行性出血热病毒分属于不同种群,群内不同血清型的S7基因ORF序列及其推导的氨基酸序列显示出很高的同源性,而不同种群之间的同源性很低。