金针菇外切-β-1,3-葡聚糖酶家族基因鉴定及在不同发育时期的差异表达

金针菇具有很高的营养与保健价值,菌柄长短决定金针菇的产量与品质,而菌柄伸长的相关作用酶及分子机理尚不清楚。前期草菇中发现外切-β-1,3-葡聚糖酶基因（exg2）可能与菌柄伸长相关,但在金针菇中尚没有exg基因的相关报道。本研究首先在金针菇全基因组中鉴定到3个外切-β-1,3-葡聚糖酶家族基因（分别命名为：Ffexg1、Ffexg2、Ffexg3）,并进行了克隆验证。进一步采用定量PCR对3个基因在金针菇不同发育时期及组织部位的差异性表达进行了分析。结果显示：Ffexg1只在菌柄中高表达,Ffexg2与Ffexg3在菌柄中表达量先上升后下降,在菌盖中呈逐渐上升趋势。3个Ffexg基因均在菌柄发生伸长的部位表达量较高,且在菇体水平放置后菌柄弯曲程度较大的部位表达量较高。结果显示金针菇exg家族3个基因存在时空差异性表达,在菌柄中伸长较快的时期及部位伴随着Ffexg基因的高表达。结合其功能预测,Ffexg家族基因可能作用于细胞壁成分β-1,3-葡聚糖链,从而在金针菇菌柄及菌盖发育中起作用。     

金针菇CA基因家族分析及其对CO2的响应

金针菇栽培通过提高栽培室CO₂浓度来抑制菌盖生长,提高商品质量。碳酸酐酶能调节CO₂/HCO₃ ^-在细胞内的平衡,它可能是响应CO₂胁迫的关键酶。本研究利用我们已完成的金针菇Flammulina filiformis的基因组测序数据,以双色蜡蘑碳酸酐酶家族基因为参照,通过本地BLAST,得到7个金针菇碳酸酐酶家族的基因,分别命名为CA-1、CA-2、CA-3、CA-4、CA-5、CA-6、CA-7。基因结构、保守结构域和系统进化分析结果均支持这7个序列是碳酸酐酶家族的编码基因。高浓度CO₂胁迫处理金针菇子实体12h,CA-1、CA-2表达量与CO₂浓度正相关,CA-5负相关,CA-3、CA-4和CA-6没有响应,CA-7无明显规律。据此推测,CA-1、CA-2和CA-5可能是金针菇响应CO₂胁迫的关键基因之一,参与调控菌盖生长发育。     

草菇芳香醇氧化酶基因vvaao1的序列特征与差异表达

对芳香醇氧化酶编码基因vvaao1序列特征及差异表达进行分析,以期为研究vvaao1在草菇基质降解与子实体发育中的生物学功能提供依据。应用ZOOM软件分析基因结构与序列准确性;通过生物信息分析网站预测氨基酸序列的信号肽、亚细胞定位及三级结构;采用MEGA 5.1构建系统发育树;结合数字基因表达谱(DGE)、荧光定量PCR(RT-q PCR)、蛋白质组(i TRAQ)分析进行差异表达分析。结果显示,vvaao1全长3 091 bp,含有9个外显子、8个内含子,开放阅读框长1 803 bp,编码600个氨基酸;生物信息分析结果显示:Vv AAO1具备信号肽,为分泌蛋白;其三级结构由20个α-螺旋和19个β-折叠组成,与模式蛋白3FIM的一致性(Identity)达到48%。进化树结果显示,Vv AAO1属于AAO家族,与侧耳属菌株Pleurotus.eryngii和P.pulmonarius的AAO序列最为接近。DGE、RT-q PCR及i TRAQ的分析结果表明,vvaao1在可孕异核体菌丝上的表达量分别是两个同核体菌株之和的51.0、49.8和2.13倍;进一步对不同发育阶段的子实体样品进行RT-q PCR检测,结果显示vvaao1在原基时期的表达量均显著高于其他时期的样品。Vv AAO1具备信号肽,为分泌蛋白,其编码基因在异核体菌株H1521的表达水平显著高于两个同核体菌株之和,存在协同增效表达,且在原基时期表达量最高,vvaao1的高表达可能有利于草菇子实体的形成。     

毛木耳白色突变体的遗传规律及分子标记开发

2016年秋季,漳州一农户种植的褐色毛木耳Auricularia cornea品种“43012H”发生白色突变,有的菌袋同时长出褐色、白色、褐色与白色交杂的颜色嵌合体耳片,有的菌袋长出白色耳片,而有的菌袋出菇颜色正常。采集白色耳片、褐色耳片和嵌合体耳片进行组织分离,得到的菌种进行栽培试验,从褐色耳片（正常）分离获得的菌种（AC_B）,种植得到正常的毛木耳子实体;从白色耳片（突变）分离获得的菌种（AC_W）,种植得到纯白色子实体;从颜色嵌合体耳片分离获得的菌种（AC_R）,栽培后也只长白色子实体,没有出现嵌合体子实体。AC_B分别与AC_W、AC_R的菌种混合接种栽培,菌袋中同时长出白色、褐色和嵌合体耳片。再次进行组织分离与栽培试验,性状稳定。对AC_B和AC_W进行基因组测序,获得2个与本研究中所用菌株的耳片颜色相关的SNP位点,即SNP1和SNP2。上述组织分离得到的菌株中,褐色菌株的基因型为SNP1 A/G（杂合）、SNP2 A（纯合）,白色菌株的基因型为SNP1 G（纯合）、SNP2 A/C（杂合）。     

草菇exo-β-1,3-葡聚糖酶基因可变剪接体的克隆与表达分析

可变剪接是基因表达调控的一种重要方式。本研究利用RT-PCR克隆鉴定到草菇exo-β-1,3-葡聚糖酶基因(exg2)的4种可变剪接体(exg2V1,exg2V2,exg2V3和exg2V4),其中,exg2V1第7个内含子保留;exg2V2第11个内含子保留同时剪切掉第12个外显子的后58bp;exg2V3同时保留第7个和第17个内含子;exg2V4同时保留第2、第9和第17个内含子。4种剪接体均在可变剪接位点提前出现终止密码子,导致预测编码的氨基酸序列中包含不完整的结构域。定量PCR结果显示:草菇5个发育时期中,4种可变剪接体表达量均比标准剪接体exg2低,但4种可变剪接体的表达也表现出一定的时期和组织差异性。初步推断发现的草菇exg2基因4种可变剪接体均为无义介导的mRNA降解,通过此方式达到对exg2基因标准剪接转录本的精准调控。     

金针菇基因组测序与组装策略分析

采用二代和三代测序技术分别对金针菇单核体菌株“6-3”进行测序,应用4种组装策略进行基因组的de novo组装,对比组装效果。基因组组装的参数方面,仅使用二代测序组装的效果最差,长度大于10kb的Contig全长只有24.6Mb,Contig N50只有23kb,组装率只有59.27%。采用三代组装二代校正的组装策略效果最好,长度大于10kb的Contig全长为38.3Mb,Contig N50为2.8Mb,组装率高达92.16%。保守单拷贝基因拼接效果方面,4种组装策略获得基因组序列与BUSCO数据库里的担子菌的保守单拷贝基因比对,基因完整性均大于94%。在组装准确性方面,经过PCR扩增、Sanger测序验证,三代组装二代校正的基因组序列完整并且连续,同时序列上碱基的SNP、InDel数量最少。综上所述,三代组装二代校正得到的基因组序列具有Contig N50值大、组装率高、碱基准确性高的特点,是食用菌基因组测序较为理想的方案。     

草菇过氧化氢酶基因(VvCAT1)异源表达及耐温度胁迫功能分析

[背景] 过氧化氢酶（catalase,CAT）参与真菌的生长发育,逆境胁迫时保护真菌免受氧化损伤。[目的] 实现草菇过氧化氢酶基因（VvCAT1）的异源表达,分析VvCAT1耐温度胁迫的功能。[方法] 克隆VvCAT1,构建过表达载体pBAR GPE1/VvCAT1,转化到大肠杆菌（Escherichia coli）菌株Stbl3中,异源表达草菇过氧化氢酶。测定温度胁迫后重组菌（pBAR GPE1/VvCAT1/Stbl3）与对照菌（pBAR GPE1/Stbl3）的过氧化氢酶活性和生长情况,验证VvCAT1的功能。[结果] 重组菌的CAT酶活性显著提高,生长情况显著优于对照菌。[结论] VvCAT1的导入及表达显著提高了大肠杆菌Stbl3的耐温度胁迫功能。     

银耳‘Tr2016’的选育报告

银耳‘Tr2016’是由福建省尤溪县枕头山的枯木上发现的一株野生银耳,进行反复多次分离和多年驯化而来。银耳菌丝具锁状联合,可形成白色或淡黄白色菌落;子实体呈雪白色,由多片波浪状卷曲的耳片组成牡丹花状,烘干后为淡黄色。栽培周期从接种到采收约45d,鲜耳平均直径13.2cm,高度7.2cm,平均产量为114.0g/瓶,干耳平均产量34.1g/瓶。     

香菇锰过氧化物酶基因（LeMnP1）生物信息学分析及高温胁迫下的表达

本研究对香菇锰过氧化物酶基因（manganese peroxidase 1,MnP1）进行了生物信息学分析,选用香菇出发菌株18和诱变菌株18N44作为实验材料,经测定高温胁迫后菌丝恢复生长速度,分析了高温胁迫过程中香菇锰过氧化物酶基因（LeMnP1）的表达水平及酶活性。结果表明：LeMnP1定位于细胞外,该蛋白属于过氧化物酶超家族,与其他担子菌具有较高的同源性。18N44在高温胁迫后其恢复能力明显强于18;在高温胁迫过程中,18N44中LeMnP1的基因表达水平均高于18,呈现先上升后下降的趋势;在未处理时,18N44的MnP活性显著高于18,随着高温胁迫时间延长,其酶活性显著下降,18的LeMnP1基因表达量及酶活性在整个高温胁迫过程中基本维持稳定。据此推测锰过氧化物酶基因的相对高表达,可能是18N44高温胁迫后恢复生长快的原因之一。     

金针菇Ⅱ类过氧化物酶基因在子实体发育与胁迫应答过程的表达特征

Ⅱ类过氧化物酶（Class Ⅱ peroxidase,CⅡp）是活性氧代谢的重要抗氧化物酶，参与机体氧化应答过程。基于金针菇全基因组数据鉴定到两个Ⅱ类过氧化物酶基因，并分别命名为FfCⅡp1、FfCⅡp2，采用在线网站软件对基因进行生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR技术分析基因在金针菇不同子实体组织和胁迫应答中的表达模式。结果显示，FfCⅡp1全长1 638 bp，包含一个1 131 bp的完整开放阅读框，编码376个氨基酸。FfCⅡp2全长1 410 bp，包含一个1 032 bp的完整开放阅读框，编码343个氨基酸。保守结构域及进化树分析表明，FfCⅡp1和FfCⅡp2分别归属于锰过氧化物酶和通用过氧化物酶家族。RT-qPCR结果表明，两个FfCⅡp基因均在伸长期菌柄中高表达，且在快速伸长区段显著上调；损伤和氧化胁迫处理均能诱导FfCⅡp1和FfCⅡp2上调表达，FfCⅡp2的上调幅度明显高于FfCⅡp1。以上结果表明，金针菇两个CⅡp家族基因参与菌柄伸长与胁迫应答过程，且FfCⅡp2对损伤和氧化胁迫更为敏感。