金针菇淀粉酶家族基因鉴定及其表达特性分析

本研究对金针菇淀粉酶家族基因进行了信息分析,并选用金针菇双核菌株H1123作为实验材料,分析了菌丝生长过程中淀粉酶活性和淀粉酶基因表达特性之间的关系。结果表明,金针菇淀粉酶家族包含6个α淀粉酶和1个γ淀粉酶。7个淀粉酶基因的表达量均在菌丝接种后第10天出现峰值,并与胞外淀粉酶活性呈同步变化,说明基质中淀粉的分解和利用是淀粉酶家族各成员之间相互协调的结果。其中α-Amy-1、α-Amy-4、α-Amy-5的上调幅度最大,为淀粉降解和代谢过程的主效基因。值得注意的是胞内淀粉酶基因α-Amy-1在第10天时达到约90倍的上调表达水平。我们推测：金针菇胞外淀粉酶将淀粉分解为小分子单糖的同时,其胞内淀粉酶也参与了这些糖类的吸收和运输过程。     

金针菇外切-β-1,3-葡聚糖酶家族基因鉴定及在不同发育时期的差异表达

金针菇具有很高的营养与保健价值,菌柄长短决定金针菇的产量与品质,而菌柄伸长的相关作用酶及分子机理尚不清楚。前期草菇中发现外切-β-1,3-葡聚糖酶基因（exg2）可能与菌柄伸长相关,但在金针菇中尚没有exg基因的相关报道。本研究首先在金针菇全基因组中鉴定到3个外切-β-1,3-葡聚糖酶家族基因（分别命名为：Ffexg1、Ffexg2、Ffexg3）,并进行了克隆验证。进一步采用定量PCR对3个基因在金针菇不同发育时期及组织部位的差异性表达进行了分析。结果显示：Ffexg1只在菌柄中高表达,Ffexg2与Ffexg3在菌柄中表达量先上升后下降,在菌盖中呈逐渐上升趋势。3个Ffexg基因均在菌柄发生伸长的部位表达量较高,且在菇体水平放置后菌柄弯曲程度较大的部位表达量较高。结果显示金针菇exg家族3个基因存在时空差异性表达,在菌柄中伸长较快的时期及部位伴随着Ffexg基因的高表达。结合其功能预测,Ffexg家族基因可能作用于细胞壁成分β-1,3-葡聚糖链,从而在金针菇菌柄及菌盖发育中起作用。     

磁场对金针菇菌丝生长的影响及磁受体和铁离子转运蛋白的鉴定表达

磁场作为一种无法避免的自然因子,对生物的生长发育有重要影响。然而,目前磁场对大型真菌影响的研究还鲜有报道。本研究采用铷磁铁对金针菇菌丝进行处理,检测金针菇菌丝在不同磁极刺激下的生长和基因表达规律。结果显示：磁场是铷磁铁抑制金针菇菌丝生长的主要原因,且在磁感应强度0.003T以上对菌丝生长的抑制作用较强。通过同源比对获得一个金针菇磁受体和一个铁离子转运蛋白的编码基因,分别命名为ff-magr和ff-fief。定量PCR结果显示ff-magr在N极和S极均出现显著下调表达,N极和S极磁场对ff-fief 的表达均无显著影响。结果表明：磁受体蛋白参与了金针菇菌丝受磁场抑制的应答过程,而磁受体不仅仅是通过调控铁的含量来调控菌丝的生长发育。以上结果为合理利用磁场调控真菌生长发育奠定基础,同时也为深入研究磁场对真菌生长发育的分子机理提供参考。     

金针菇CA基因家族分析及其对CO2的响应

金针菇栽培通过提高栽培室CO₂浓度来抑制菌盖生长,提高商品质量。碳酸酐酶能调节CO₂/HCO₃ ^-在细胞内的平衡,它可能是响应CO₂胁迫的关键酶。本研究利用我们已完成的金针菇Flammulina filiformis的基因组测序数据,以双色蜡蘑碳酸酐酶家族基因为参照,通过本地BLAST,得到7个金针菇碳酸酐酶家族的基因,分别命名为CA-1、CA-2、CA-3、CA-4、CA-5、CA-6、CA-7。基因结构、保守结构域和系统进化分析结果均支持这7个序列是碳酸酐酶家族的编码基因。高浓度CO₂胁迫处理金针菇子实体12h,CA-1、CA-2表达量与CO₂浓度正相关,CA-5负相关,CA-3、CA-4和CA-6没有响应,CA-7无明显规律。据此推测,CA-1、CA-2和CA-5可能是金针菇响应CO₂胁迫的关键基因之一,参与调控菌盖生长发育。     

草菇芳香醇氧化酶基因vvaao1的序列特征与差异表达

对芳香醇氧化酶编码基因vvaao1序列特征及差异表达进行分析,以期为研究vvaao1在草菇基质降解与子实体发育中的生物学功能提供依据。应用ZOOM软件分析基因结构与序列准确性;通过生物信息分析网站预测氨基酸序列的信号肽、亚细胞定位及三级结构;采用MEGA 5.1构建系统发育树;结合数字基因表达谱(DGE)、荧光定量PCR(RT-q PCR)、蛋白质组(i TRAQ)分析进行差异表达分析。结果显示,vvaao1全长3 091 bp,含有9个外显子、8个内含子,开放阅读框长1 803 bp,编码600个氨基酸;生物信息分析结果显示:Vv AAO1具备信号肽,为分泌蛋白;其三级结构由20个α-螺旋和19个β-折叠组成,与模式蛋白3FIM的一致性(Identity)达到48%。进化树结果显示,Vv AAO1属于AAO家族,与侧耳属菌株Pleurotus.eryngii和P.pulmonarius的AAO序列最为接近。DGE、RT-q PCR及i TRAQ的分析结果表明,vvaao1在可孕异核体菌丝上的表达量分别是两个同核体菌株之和的51.0、49.8和2.13倍;进一步对不同发育阶段的子实体样品进行RT-q PCR检测,结果显示vvaao1在原基时期的表达量均显著高于其他时期的样品。Vv AAO1具备信号肽,为分泌蛋白,其编码基因在异核体菌株H1521的表达水平显著高于两个同核体菌株之和,存在协同增效表达,且在原基时期表达量最高,vvaao1的高表达可能有利于草菇子实体的形成。     

金针菇单、双核菌丝差异表达基因分析

对金针菇Flammulina velutipes单核菌丝W23的菌丝体以及与L11质配后的双核菌丝H1123菌丝体进行了转录组测序,以本实验室已获得的W23基因组为参考基因组研究两样本间差异基因,并对这些差异基因进行了GO功能和Pathway显著性富集分析。差异基因分析显示,两个样本中共有显著性差异表达的基因3 504个,其中在双核菌丝中上调、下调的基因数分别为2 151和1 353个。研究发现差异表达基因含有很多的转录因子基因、蛋白激酶以及WD40 repeat-like蛋白。Gene Ontology（GO）功能分析结果表明,extracellular region和membrane-enclosed lumen条目下的差异基因全部为上调表达,而envelope下的差异基因全部为下调表达,以利于双核菌丝分裂时锁状联合的形成而便于核的迁移。Pathway 功能富集分析结果表明,脂肪酸、氨基酸以及大部分糖类合成相关基因具有比较活跃的上调表达。说明双核菌丝主要进行营养物质的富集,为下一步在合适条件下分化成原基,进入生殖生长阶段储备物质基础。     

中国野生发光真菌新记录种Neonothopanus nambi的分离、鉴定及其形态观察

【目的】在中国福建地区采集分离一株野生发光真菌,菌种编号为MRC-lf3,对其进行形态观察及分子鉴定以确定其分类地位,并观察其整个生活史的形态特征。【方法】采用组织分离技术获得野生发光真菌纯培养物,结合形态学及ITS进化分析确定该菌的分类地位,应用单反相机记录子实体不同生长时期的形态特征及发光情况。【结果】该发光真菌的菌丝、子实体、孢子的形态均与Neonothopanus nambi最为相似,ITS序列的进化分析结果也支持该发光真菌为Neonothopanus nambi。其子实体颜色深浅和发光强度均受到光照强度的影响,光照可使子实体颜色变暗、发光强度减弱。【结论】从福建省福州市采集分离获得一株大型野生发光真菌,经鉴定该菌为Neonothopanus nambi,是中国首次发现的Neonothopanus属真菌,该发现也将中国大陆的野生发光真菌总数增加至8种。     

不饱和脂肪酸参与调控金针菇菌柄伸长的潜在分析

金针菇Flammulina filiformis菌柄是产量构成的重要组成部分,也是评价质量的重要指标。菌盖下方0.6-1.5cm是菌柄的伸长区,其他区段不伸长。为了研究菌柄伸长的调控机制,我们采用液相色谱-串联质谱联用（LC-MS/MS）技术对金针菇菌柄的伸长区、过渡区和非伸长区进行检测,结合层次聚类分析（HCA）、t检验等统计学方法对差异代谢物进行研究,并通过KEGG分析代谢物富集情况。结果显示,共有69种代谢物在伸长区、过渡区和非伸长区呈现梯度差异,其中52种代谢物含量为梯度性降低,17种代谢物为梯度性增加。这些差异代谢物主要归属于脂肪酸、氨基酸、核苷酸、生物碱等,其中脂肪酸及其衍生物占主导地位,尤其是油酸、花生四烯酸和肾上腺酸含量在菌柄伸长区显著高于其他区段。根据金针菇菌柄的代谢物积累特点,推测脂肪酸及其衍生物可能参与调控金针菇菌柄伸长。     

草菇exo-β-1,3-葡聚糖酶基因可变剪接体的克隆与表达分析

可变剪接是基因表达调控的一种重要方式。本研究利用RT-PCR克隆鉴定到草菇exo-β-1,3-葡聚糖酶基因(exg2)的4种可变剪接体(exg2V1,exg2V2,exg2V3和exg2V4),其中,exg2V1第7个内含子保留;exg2V2第11个内含子保留同时剪切掉第12个外显子的后58bp;exg2V3同时保留第7个和第17个内含子;exg2V4同时保留第2、第9和第17个内含子。4种剪接体均在可变剪接位点提前出现终止密码子,导致预测编码的氨基酸序列中包含不完整的结构域。定量PCR结果显示:草菇5个发育时期中,4种可变剪接体表达量均比标准剪接体exg2低,但4种可变剪接体的表达也表现出一定的时期和组织差异性。初步推断发现的草菇exg2基因4种可变剪接体均为无义介导的mRNA降解,通过此方式达到对exg2基因标准剪接转录本的精准调控。     

草菇子实体不同成熟阶段的比较蛋白质组学分析

采用iTRAQ标记结合二维液相色谱串联质谱技术对草菇不同成熟阶段的差异蛋白质组进行研究。首先将提取的草菇不同成熟阶段蛋白样品进行SDS-PAGE分析,其次将经二维液相色谱串联质谱技术获取的串联质谱数据通过MASCOT软件搜库,之后对鉴定蛋白质数据进行了KEGG代谢通路分析。试验共计获得2 335个不同肽段, 鉴定到1 039个蛋白质,其中1 030个蛋白质具有定量信息。与蛋形期相比,在伸长期和成熟期阶段显著上调蛋白质85个,下调蛋白质103个。KEGG代谢通路分析结果显示,草菇不同成熟阶段中的68个差异蛋白质可定位于4种伞菌目模式真菌（灰盖鬼伞、双色蜡蘑、可可丛枝病菌和裂褶菌）的45个不同生物代谢途径,全景展示出草菇成熟阶段差异表达蛋白质定位的代谢网络。结果表明,iTRAQ标记技术结合二维液相色谱串联质谱可对不同生长发育时期的草菇蛋白样品进行有效地分离和鉴定。