狂犬病病毒CVS-11株全序列测定及其感染性克隆的构建

[目的]测定狂犬病病毒标准攻击毒CVS-11株全基因组序列,构建CVS-11株全长cDNA感染性克隆.[方法]RT-PCR扩增CVS-11株全基因组得到有重叠的12个片段,分别克隆至平端载体pEASY-Blunt,测定CVS-11株全基因组核苷酸序列.用软件DNAMAN分析CVS-11全序列单一性酶切位点,设计引物,分4段扩增CVS-11全基因组,扩增产物经多步酶切、连接逐步插入至真核表达载体pcDNA3.1,获得全长质粒pcDNA3.1-CVS-11.pcDNA3.1-CVS-11与其辅助质粒pcDNA3.1-N、P、L、G共转染NA细胞,经免疫荧光染色、RT-PCR鉴定,拯救得到重组病毒rCVS-11.[结果]CVS-11全基因组序列由11 927个核苷酸组成,编码5个结构蛋白,结构基因排列同已知的其他狂犬病病毒一致.成功构建了CVS-11全长cDNA重组质粒pcDNA3.1-CVS-11和其辅助质粒pcDNA3.1-N、P、L和G.经共转染,成功拯救了重组病毒rCVS-11.[结论]CVS-11株感染性克隆的构建为从分子水平上进一步研究狂犬病病毒奠定了基础.     

犬瘟热病毒CDV-3株感染性克隆的构建与鉴定

以国内商品化水貂犬瘟热病毒疫苗所用毒株CDV-3为模板,构建犬瘟热病毒感染性c DNA克隆,为犬瘟热病毒新型疫苗研制、致病机理研究提供理论基础。设计13对引物对其全基因组序列测定,分析单一酶切位点,将CDV-3的全长分5个片段进行RT-PCR扩增。经酶切拼接,将5个片段顺次插入到酶切位点改造后的真核载体pc DNA3.2的多克隆酶切位点处,同时在F1首端和F5末端分别加入锤头状核酶和丁型肝炎核酶序列,获得CDV-3株的全长c DNA质粒(pcDNA3.2-CDV-3)。构建表达CDV-3 N、P、L蛋白的3个辅助质粒。利用转染试剂Lipofectamine~(TM) 2000将全长质粒和3个辅助质粒共转染293T细胞,3 d后,将上清接种到Vero细胞。观察犬瘟热病毒典型合胞体病变,对重组病毒进行免疫荧光鉴定和标签鉴定。最后,比较wtCDV-3和rCDV-3的生长特性。全长质粒和辅助质粒的酶切鉴定和序列测序均正确。拯救的重组病毒能在Vero细胞上形成典型的合胞体病变,经RT-PCR、间接免疫荧光和电镜观察鉴定,证明成功拯救出重组病毒rCDV-3株。rCDV-3的病毒滴度最高达到10~(7.667) TCID_(50)/mL,比wtCDV-3的滴度10~(6.667) TCID_(50)/mL高出约10倍。rCDV-3感染Vero细胞后,迅速大量增殖,于感染后36 h达到最高病毒滴度。而wt CDV-3增殖平缓,感染后72 h时病毒含量达到最大。文中建立的高效CDV-3株反向遗传操作平台,为犬瘟热病毒新型疫苗研制和致病机理研究奠定基础。     

人呼吸道合胞病毒兰州株基因组全长cDNA克隆的构建及鉴定

目的构建用于呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)体外拯救的RSV基因组全长cDNA克隆,并进行鉴定。方法根据RSV Long株基因组序列设计并合成引物,利用RT-PCR技术分6段扩增RSV LZ01/09基因组序列并构建克隆载体;测序后,利用重叠PCR与酶切连接技术,根据基因组序列选择特异性酶切位点,引入Kpn I、Xma I和Sal I酶切位点,构建成4个亚克隆载体;将亚克隆载体的插入片段连接至经过改造且包含T7启动子、锤头状核酶、多克隆位点、丁肝核酶、T7终止子的p RSV1载体中,构建RSV基因组全长cDNA克隆;对克隆全长cDNA序列进行测定,与亲本RSV LZ01/09基因组进行同源性比对分析,并与RSV实验参比株进行系统进化树分析。结果测序结果显示,RSV LZ 01/09的基因组全长为15 204 bp,与GenBank公布的RSV基因组序列长度相当,将完整的序列提交GenBank,登录号为KY782635;酶切及测序结果显示,用于RSV全长cDNA克隆构建的基本载体p BSKS-MCS(简称p RSV1)与预期相符,RSV全长基因组cDNA克隆质粒(简称转录载体p RSV1-4F)酶切片段大小与预期一致;同源性比对结果显示,全长cDNA序列与亲本RSV LZ01/09基因组序列同源性高达99.83%;系统进化树分析结果显示,其与RSV-A亚型序列同属于一个分支。结论测序及酶切分析结果表明已成功构建RSVLZ01/09基因组全长cDNA克隆,为建立拯救RSV重组病毒的反向遗传学系统平台奠定了基础。     

负链不分节段RNA病毒反向遗传系统中通用型真核表达载体的构建

本研究选择pVAX1作为供体载体,通过分子克隆方法,分别用人工合成的锤头型核酶、丁型肝炎核酶序列(用于获得转录后病毒基因组RNA的精确末端)和含有9个常用限制性酶切位点的linker序列(用于病毒基因组插入的多克隆酶切位点)取代真核表达载体pVAX1的多克隆酶切位点,将其改造成负链不分节段RNA病毒反向遗传系统的通用型表达载体。通过酶切鉴定和序列测定表明,pVAX1载体中插入的核酶及linker序列正确无误,并将CTN株狂犬病病毒全长基因组cDNA插入pVAX-R中,通过与辅助质粒的共转染成功拯救CTN株狂犬病毒,证明通用型真核表达载体构建成功,为快速建立负链不分节段RNA病毒反向遗传系统奠定基础。     

麻疹病毒全长cDNA构建及其感染性的研究

为发展新型疫苗和改造目前使用的麻疹病毒疫苗,以麻疹病毒疫苗株为模板,构建了具有感染性的麻疹病毒cDNA克隆.用RT-PCR分6段扩增出麻疹病毒全长基因,通过酶切、拼接构建麻疹病毒疫苗株CC-47的全长正链cDNA序列,并精确地置于T7启动子控制下与丁型肝炎病毒核酶序列之前.克隆麻疹病毒CC-47株蛋白N、P、L编码区质粒并置于T7启动子控制下,用4个质粒共转染哺乳动物细胞,在表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒VTF7-3的作用下进行病毒拯救.经免疫荧光、PCR等方法检测证实,获得了具有感染性的麻疹病毒.所拯救的病毒在哺乳动物细胞连续传3代后,仍能检出病毒抗原和核酸.     

犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒的构建及免疫效果评估

研究选取犬瘟热病毒H蛋白基因为目的基因,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、酶切、连接等方法构建出重组人5型腺病毒穿梭质粒和骨架质粒,两者共转染293AD细胞并包装出重组腺病毒。通过电镜负染、酶切鉴定、Western blot及一步生长曲线测定等方法进行病毒的生物学特性鉴定,证明犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒构建正确。犬分别肌肉接种CDV疫苗毒和重组腺病毒,并检测免疫后第14,28,42,56,70,84d时犬血清中抗CDV中和抗体的变化情况。结果显示,犬免疫重组腺病毒后体内产生的抗CDV平均中和抗体水平高于对照组,滴度最高达2-8。研究表明,正确构建的重组腺病毒具有良好的免疫原性,诱导产生的抗犬瘟热病毒中和抗体达到犬最低免疫保护水平,为进一步研发犬瘟热病毒活载体疫苗提供理论依据。     

犬瘟热病毒南京株H蛋白基因的克隆与表达

根据发表的犬瘟热病毒(CDV)参考株Ondetstepoort的序列设计一对引物,以犬瘟热病毒南京株(CDVNJ-15)感染的Vero细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增出1.9kb的全长H蛋白基因,双酶切该全长基因,得到1058bp片段,以正确的阅读框架定向克隆于pET-28b(+)中,然后将重组质粒转化宿主菌RosettaTM,在37℃1.0mmol/LIPTG诱导下获得良好表达.经SDS-PAGE鉴定,表达的融合蛋白质约38kDa,与预期值一致.免疫转印试验显示,该重组蛋白可被CDVOnderstepoort兔抗血清识别,表明该重组蛋白具备部分抗原性.     

兔防御素(MCP-1)cDNA的克隆与序列分析

从兔脾脏细胞中分离提取总RNA,经反转录PCP(RT-PCR)扩增出兔巨嗜细胞阳离子多肽(MCP-1)cDNA,插入经EcoRI和XbaI双酶切的pUC19中,构建了克隆质粒pUCDEF.进行了限制性酶切鉴定和序列分析,结果在扩增出的cDNA288个碱基中,在前片段中有一个碱基与发表的兔MCP-1cDNA序列不同,即第157位碱基由G变为A,导致编码的氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸.该cDNA全长288bp,编码94个氨基酸,由编码信号肽,前片段及成熟肽片段的序列组成.     

口蹄疫病毒泛亚型O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建和感染性鉴定

设计并合成了O型口蹄疫泛亚型代表毒株O/CHINA/99基因组9条引物,利用RT-PCR扩增各基因片段,酶切后连到pOK-12载体上,经酶切、PCR和序列测定表明,O/CHINA/99全基因组由8 200个核苷酸组成,构建的感染性cDNA与原毒株的序列同源性为99.1%;利用T7 RNA聚合酶系统进行体外转录,转录产物RNA用脂质体转入BHK-21细胞传代培养,可观察到典型的FMDV致细胞病变效应;拯救病毒接种2日龄乳鼠后,可出现典型的临床症状,并于16～48h内死亡。以上结果表明,O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建成功,并从构建的全长cDNA拯救出了口蹄疫病毒。     

基于双质粒拯救系统的新城疫病毒LaSota株的拯救

传统新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)的拯救系统包括一个cDNA克隆质粒和分别表达NDV的核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、聚合酶蛋白(L)的3个辅助质粒,且必须满足4个质粒同时转染进入同一个宿主细胞才能完成病毒的组装,效率相对低下。【目的】提高NDV的拯救效率,并建立双质粒高效拯救系统。【方法】将NP、P、L基因表达盒串联克隆至真核表达载体pCI中,构建为可同时表达NP、P、L蛋白的单辅助质粒PCI-NPL;同时,采用分段克隆再拼接的方式,将NDV LaSota株基因组cDNA克隆于真核表达质粒pCI的CMV启动子下游,并分别在P和M基因中插入报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)、5''端引入锤头状核酶序列、3''端引入丁型肝炎病毒核酶序列,构成全基因组转录质粒pCI-LaSota-EGFP;以pCI-LaSota-EGFP和pCI-NPL组成病毒拯救系统共转染至BHK-21细胞,拯救获得重组子代病毒rLaSota-EGFP,并进行系列生物学特性鉴定。【结果】经RT-PCR、荧光显微镜观察、Western blotting、生长特性测定等系列鉴定,证明rLaSota-EGFP构建正确,成功拯救获得了重组病毒rLaSota-EGFP,且与野生型(wild-type, WT) LaSota具有相似的生物学特性。【结论】基于CMV启动子的NDV双质粒新型拯救系统构建成功,为重组NDV及其他副黏病毒的高效拯救奠定了基础。     

Ⅰ类新城疫病毒NDV08-004株病毒拯救体系的建立

根据Ⅰ类新城疫病毒NDV08-004基因组序列(GenBank登录号FJ794269),设计7对引物,采用RT-PCR将NDV08-004基因组分段扩增(片段A～G)并分别克隆入pGEM-Teasy载体,然后采用单一的酶切位点将7个片段依次亚克隆到转录载体pOLTV5中,构建了含NDV08-004全基因组cDNA的转录载体NDV08-004-pO。采用构建的三个辅助质粒(pCI-NP、pCI-P和pCI-L)与基因组NDV08-004-pO按照2:1:1:2的比例共转染BSR T7/5细胞,结果成功拯救出具有血凝性的NDV08-004,初代分离物血凝价为4.33log2±0.58。Ⅰ类NDV反向遗传操作体系的建立为开展Ⅰ类NDV的致病机制奠定了基础。     

鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi株感染性分子克隆的构建及病毒拯救

参照GenBank上公布的鸽源Ⅵb亚型新城疫病毒JS/07/04/Pi株基因组全序列设计9对引物,RT-PCR扩增目的片段后,依次亚克隆至TVT7/R转录载体,成功构建出含JS/07/04/Pi株基因组全长cDNA的转录载体TVT/071204。然后将其与三个辅助表达质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BSR-T7/5细胞,60h后将转染细胞及其上清接种鸡胚,收集死亡鸡胚尿囊液进行HA与HI试验。结果显示死亡鸡胚尿囊液HA呈阳性,并能被ND阳性血清所抑制,表明该病毒已成功拯救,且拯救病毒rNDV/071204在细胞上的生长增殖能力同母本病毒相似。该病毒的成功拯救为鸽源Ⅵb亚型NDV感染的宿主特异性及鸽用ND新型疫苗的研究提供了理想的生物材料。     

1型鸭肝炎病毒CL株感染性分子克隆的构建

摘要：【目的】构建1型鸭肝炎病毒（DHV）的感染性克隆,用于研究其基因组的结构与功能。【方法】用RT-PCR方法扩增出覆盖整个1型鸭肝炎病毒CL株基因组3个忠实性片段,并按顺序组装进载体pBR322中,获得全长cDNA克隆（BR-CL）。将BR-CL在体外转录出的RNA转染鸭胚肾细胞,并传至第6代,利用RT-PCR方法和间接免疫荧光试验进行鉴定。将获得的子代病毒（CL-R）在SPF鸡胚上传代,观察鸡胚死亡及胚体病变情况。通过胶体金免疫电镜观察子代病毒粒子的形态。【结果】RT-PCR、间接免疫荧光和胶体金免     

青杄均一化cDNA文库构建及EST序列分析

以青杄花粉和针叶为材料,将青杄全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了其非剪切型全长cDNA原始文库,利用基因组DNA饱和杂交技术对原始cDNA文库进行均一化处理,构建青杄的均一化全长cDNA文库。文库的总库容量为1.1×106CFU/mL,平均插入片段长度大于1.0 kb,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,青杄高丰度表达基因EF1-α在均一化cDNA文库中的表达量下降了约41倍。接着对文库中随机的5 144个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressedsequence tag)序列为5 144条,经拼接共获得单一基因(unigene)为2 717个,其中包括片段重叠群(contig)628个和单一EST序列(singlet)2 089个。NCBI同源比对分析表明,其中1 887个序列unigenes获得分子功能注释,这些EST涉及细胞生长、信号转导、转录、抗逆、能量代谢等功能。这些数据有助于对青杄的相关功能蛋白及分子机制开展进一步的研究。     

M yb28基因表达载体的构建及拟南芥转化

利用通过RT-PCR扩增到的M yb28(GenBank注册号:HQ270468)基因分别构建正义和反义植物表达载体,采用冻融法转入农杆菌LBA4404菌株,通过花序浸泡法对Myb28基因缺失的拟南芥进行了遗传转化,经RT-PCR和酶切鉴定,结果表明Myb28正义和反义真核表达载体构建成功,经基因组PCR鉴定表明正义表达载体已成功整合到拟南芥基因组中。