禽流感病毒样颗粒研究进展

病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是指由病毒一个或几个结构蛋白自行组装成不含病毒基因组且不能复制、不具有感染能力的病毒样蛋白颗粒。VLPs因能够模拟天然病毒的构象表位而保持了完整病毒颗粒所具有的免疫原性,可诱导机体产生广泛强大的抗病毒免疫反应,阻止病毒侵入机体,在抗病毒性疾病的预防或治疗性疫苗及诊断试剂的研究开发方面具有巨大的应用前景。本文就禽流感病毒样颗粒相关研究进展进行综述,以期为我国禽流感VLPs的研究提供参考。     

与朊毒体相关的鱼类朊蛋白研究概况

疯牛病(mad cow disease),即牛传染性海绵状脑病(bovine transmissible spongiform encephalopathy,BSE)的俗称,是一种慢性消耗性、致死性、中枢神经系统退行性疾病。疯牛病被认为与朊毒体(Prion)有关,朊毒体是由正常朊蛋白(Prion protein,或者PrPC)发生构象改变后形成的异常蛋白(PrPSc)。疯牛病的发生引起了世界各国政府和科学界的高度重视,PrP的起源及其功能研究已成为研究热点。鱼类PrP相关蛋白的研究正在展开中,由于鱼类PrP相关蛋白与朊蛋白的结构相似,鱼类感染TSE类似病存在理论上的风险。本文全面地综述了疯牛病的概况、朊毒体的特性、朊毒体与哺乳动物朊蛋白、鱼类PrP相关蛋白(PrP1、PrP2和PrP3)及鱼类其他PrP相关蛋白的研究情况,为国内水生动物PrP相关蛋白研究提供参考。     

新城疫强毒株荧光定量RT-PCR检测技术的建立及应用

基于国内流行的新城疫病毒强毒株F蛋白裂解位点分子特征设计特异性引物及Taqman探针,建立了一种可检测新城疫强毒株的一步法实时荧光定量RT-PCR方法。通过体外转录法制备cRNA标准品作为阳性模板制作标准曲线以及临床样品的检测绘制出ROC曲线,对诊断指标进行系统评价。结果显示:该方法的标准曲线为Y=-3.390X+38.23,相关系数R~2为0.9999;灵敏度试验显示,该方法的最低检测限为2拷贝/μL,比常规RTPCR高10倍;特异性试验显示该方法与常见禽病病毒无交叉反应;重复性试验的组内和组间的变异系数分别低于1%和1.5%。通过检测1 974份临床样品绘制ROC曲线显示,ROC曲线下面积为0.9861,当Youden Index为93.12时,cutoff值设为35,诊断的敏感性和特异性分别为94.82%、98.3%,与病毒分离方法的Kappa系数为0.919。本研究建立的方法敏感性高、特异性强、重复性好、诊断准确性极好,给实验室提供一种快速、实用的检测临床样品的方法。     

焦磷酸测序技术在禽流感病毒金刚烷胺耐药性检测中的应用

流感病毒M2蛋白五个关键位点氨基酸残基(第26、27、30、31和34位)中的任何一个发生突变都会导致抗流感病毒药物中金刚烷胺抗药性的产生。本研究利用焦磷酸测序技术对94株不同亚型禽流感病毒金刚烷胺耐药性分子决定区进行了鉴定,并进行抗药性分析。结果表明94株禽流感病毒中有81株M2基因存在金刚烷胺耐药性的分子标签,其余的13株根据分子标签判断为对金刚烷胺敏感。耐药性的分子标记存在V27I和S31N两种突变形式,其中绝大多数为S31N。     

检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的重组N蛋白-ELISA的建立

将已构建成菌的重组质料Petn转化入E.coli BL21(DE3)中,在最佳诱导条件下获得重组N蛋白.随后用His-Bind对表达产物进行纯化,对纯化效果及纯化产物的特异性分别用SDS-PAGE电泳及Western-blot试验检测.在此基础上,以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,对各种条件进行优化(如抗原的包补,作用时间及底物的选择),确定了判定标准,建立了检测PRRS抗体的间接ELISA方法.用此方法检测了200份血清样品,并与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果相比较,符合率达91%.     

蛋白质错误折叠循环扩增技术

目前发现有多种人类及动物疾病是由体内蛋白质的错误折叠引起的,其中朊毒粒病因具有传染性而备受关注.朊毒粒病研究的核心问题之一是正常细胞朊蛋白（PrPc）向异常致病朊毒粒（PrPsc）转变的机制.蛋白质错误折叠循环扩增技术（protein misfolding cyclic amplification,PMCA）就是最新发明的在体外诱导朊蛋白（PrPc）产生错误折叠生成朊毒粒（prpsc）的技术.该文将概要介绍此项技术的原理、技术要点及在诊断与基础研究方面的应用前景.     

Real—time TaqMan RT—PCR快速检测犬瘟热病毒方法的研究

按照犬瘟热（CDV）N基因序列,设计合成了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了Real—time荧光定量RT—PCR技术,对细胞培养物、肝脏、肺脏、脑、脾脏、淋巴结以及鼻腔拭子等组织病料中的CDV进行了特异性检测和敏感性试验。同时,利用建立的Real—time荧光定量RT—PCR方法与常规RT—PCR以及韩国BIOINDIST生产的BITRAPIDCDV检测试剂盒对57份临床样品进行了检测。结果：用20pmol／mL的引物浓度各luL和20pmol／mL的探针浓度0.3uL,获得的荧光信号最强,曲线平滑。敏感性高,可检测到1.24×3ng／uL的病毒RNA;特异性强,与NDV、AIV、NiPV等RNA病毒不发生交叉反应。试验重复性的变异系数（CV）分别为2．3％、2．5％和4.2％;与常规RT—PCR和BIOINDIST生产的BITRAPIDCDV检测试剂盒相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点。     

中国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gei/07-30磷蛋白基因的分子特征及其编码蛋白特性分析

对我国西藏小反刍兽疫病毒野生株China/Tib/Gej/07-30进行磷蛋白基因序列测定,并进行分子生物学特征分析。首先应用逆转录聚合酶链式反应扩增出病毒磷蛋白基因片段,对聚合酶链式反应产物进行直接测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析。小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30磷蛋白基因由1 655个核苷酸组成,编码2个相互交叠的开放阅读框(ORF)。第一个ORF长度为1 530个核苷酸,编码的P蛋白长度为509个氨基酸。第二个ORF长度为534个核苷酸,编码的C蛋白长度为177个氨基酸。第一个ORF通过基因编辑在751位插入1个G核苷酸,转录生成第二个mRNA,长度为897个核苷酸,编码的V蛋白长度为298个氨基酸。小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的P蛋白与其他分离株氨基酸序列同源性为86.1%～97.3%,C蛋白氨基酸序列相似性为84.3%～94.9%,V蛋白为82.9%～96.3%。China/Tib/Gej/07-30的P蛋白第315～387位氨基酸是一段高度保守的七肽重复序列。     

我国西藏小反刍兽疫病毒China／Tib／Gej／07—30核衣壳蛋白基因和基因组启动子区的分子特征分析

首次对我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的核衣壳蛋白(N)基因和基因组启动子(GP)区进行序列测定和分子生物学特征分析。首先应用逆转录聚合酶链式反应从发病山羊病料中扩增出小反刍兽疫病毒N基因片段,用cDNA3′末端快速扩增方法获得基因组启动子区片段,对聚合酶链式反应产物进行直接测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,绘制系统发生树。我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的N基因由1689个核苷酸组成,编码525个氨基酸,与India/Jhansi/03等6个已知N基因全序列的PPRV毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.7～97.6和94.9～98.5。小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30N蛋白与磷蛋白作用的结构序列之一为495LFRLQAM501保守序列,N蛋白281-289位氨基酸含有一个T细胞表位,为281YPALGLHEF289保守序列。小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的GP区由107个核苷酸组成,与Tur-key2000等5株其他PPRV毒株同源性为91.8～98.2。N基因核苷酸序列和相应的氨基酸序列系统进化分析表明小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30与亚洲国家分离株关系最近。