五株鸽副粘病毒国内分离株F基因片段的克隆与分子特性

鸽Ⅰ型副粘病毒病(鸽瘟)是由鸽Ⅰ型副粘病毒(Pigeon paramyxivirus-Ⅰ,PPMV-Ⅰ)引起的一种高度接触性传染病,是危害养鸽业的主要疫病之一.     

整合禽流感病毒血凝素糖蛋白的假型鼠白血病病毒

本研究通过一个瞬时转染系统将H5N1亚型鹅源禽流感病毒囊膜表面的血凝素(HA)糖蛋白整合到鼠白血病病毒(MuLV)颗粒表面并进行了感染性测定.将包含HA基因的真核表达质粒pcDNA-HA与MuLV假病毒构建体系的两种质粒pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol)和pHIT111(为MuLV的基因组,还包括一个报告基因LacZ)瞬时共转染转化了SV40大T抗原的人胚肾细胞293T,48小时后收集假病毒上清进行了一系列鉴定.将假病毒上清超速离心后用抗H5亚型禽流感病毒的多抗通过Western-blot证实HA 蛋白能够在此假病毒颗粒表面表达,表明HA能够整合到此病毒粒子表面.通过感染293T、COS-7和NIH3T3三种不同的靶细胞,均能检测到LacZ基因的表达,证实所构建的假病毒粒子具有感染性.本研究成功构建了具有感染性的MuLV-HA假病毒,为研究鹅源禽流感病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法.     

禽流感病毒血凝素基因突变体的构建及其在293T细胞中的表达

采用PCR定点突变技术,通过重叠延伸法3次PCR扩增,扩增片段上含有所需要的突变位点,最后将扩增片段克隆入pcDNA3载体中,DNA测序表明在预期位点已经发生突变,HA基因裂解位点的氨基酸组成为RKKR↓GLF突变为RSSR↓GLF,通过磷酸钙共沉淀方法将HA基因突变体的重组质粒瞬时转染293T细胞,采用间接免疫荧光鉴定其表达情况。IFA证实突变后的HA在细胞膜上获得了有效表达。HA基因突变体的成功构建,为进一步研究该突变位点导致AIV进入细胞的发病机制和HA蛋白的结构和功能的关系奠定了基础。     

H9N2亚型AIVHA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank公开发表的禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus,AIV)H9N2亚型血凝素基因(HA)序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pUCHA中扩增H9N2亚型禽流感病毒去除信号肽的血凝素基因,将该片段定向插入到原核表达载体pET32a(+)中,构建原核表达载体pETHA。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,HA基因获得表达,经定位分析,目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定了表达HA基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.7mmol/L,诱导时间为3h。Westernblot分析表明,重组蛋白能与H9N2亚型AIV阳性血清发生特异性反应。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测H9亚型AIV抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为25μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:OD待检血清>0.5且OD标准阳性血清>1.0;OD标准阴性血清<0.1。     

焦磷酸测序技术在禽流感病毒金刚烷胺耐药性检测中的应用

流感病毒M2蛋白五个关键位点氨基酸残基(第26、27、30、31和34位)中的任何一个发生突变都会导致抗流感病毒药物中金刚烷胺抗药性的产生。本研究利用焦磷酸测序技术对94株不同亚型禽流感病毒金刚烷胺耐药性分子决定区进行了鉴定,并进行抗药性分析。结果表明94株禽流感病毒中有81株M2基因存在金刚烷胺耐药性的分子标签,其余的13株根据分子标签判断为对金刚烷胺敏感。耐药性的分子标记存在V27I和S31N两种突变形式,其中绝大多数为S31N。     

新城疫强毒株荧光定量RT-PCR检测技术的建立及应用

基于国内流行的新城疫病毒强毒株F蛋白裂解位点分子特征设计特异性引物及Taqman探针,建立了一种可检测新城疫强毒株的一步法实时荧光定量RT-PCR方法。通过体外转录法制备cRNA标准品作为阳性模板制作标准曲线以及临床样品的检测绘制出ROC曲线,对诊断指标进行系统评价。结果显示:该方法的标准曲线为Y=-3.390X+38.23,相关系数R~2为0.9999;灵敏度试验显示,该方法的最低检测限为2拷贝/μL,比常规RTPCR高10倍;特异性试验显示该方法与常见禽病病毒无交叉反应;重复性试验的组内和组间的变异系数分别低于1%和1.5%。通过检测1 974份临床样品绘制ROC曲线显示,ROC曲线下面积为0.9861,当Youden Index为93.12时,cutoff值设为35,诊断的敏感性和特异性分别为94.82%、98.3%,与病毒分离方法的Kappa系数为0.919。本研究建立的方法敏感性高、特异性强、重复性好、诊断准确性极好,给实验室提供一种快速、实用的检测临床样品的方法。     

应用焦磷酸测序技术快速检测猪流感病毒金刚烷胺耐药性的分子标签

【目的】本研究旨在通过焦磷酸测序技术对我国分离的H1N1、H3N2、H9N2等3种基因型的10株猪流感病毒分离株进行金刚烷胺耐药性鉴定。【方法】流感病毒M2蛋白5个关键位点氨基酸残基(第26、27、30、31和34位)中的任何一个发生突变会导致抗流感病毒药物中金刚烷胺抗药性的产生。本研究利用焦磷酸测序技术对2004-2008年国内分离的10株猪流感病毒M基因金刚烷胺耐药性分子决定区进行了鉴定,并进行抗药性分析。【结果】基于M2蛋白基因保守区序列建立的焦磷酸测序技术能用于国内猪流感病毒的快速检测,且具有较好的特异性和重复性。抗药性分析表明10株猪流感病毒国内分离株中5株H1N1分离株全部耐药,主要存在M2蛋白的V27T、V27I或S31N位点的突变,而4株H3N2和1株H9N2猪流感病毒分离株在M2蛋白5个关键位点上均未出现变异,表明其对金刚烷胺敏感。【结论】基于M基因的焦磷酸测序技术可以用于我国猪流感病毒金刚烷胺耐药性快速鉴定。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的重组鼠白血病病毒的特性

通过反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)扩增了H5N1亚型鹅源禽流感病毒 (AIV)完整的血凝素 (HA)基因并进行了克隆与鉴定。序列测定结果已经登陆GenBank ,登陆号为AY6 394 0 5。序列分析表明所扩增的HA基因开放性阅读框架 (ORF)由170 7个核苷酸组成 ,共编码 5 6 8个氨基酸 ,裂解位点的氨基酸组成为RKKR↓GLF ,含连续的碱性氨基酸 ,具有高致病性AIVHA基因裂解位点的特征。构建了含HA基因的真核表达载体pcDNA HA ,通过与鼠白血病病毒 (MuLV)假病毒构建体系的两种质粒pHIT6 0和pHIT111共转染人胚肾细胞 2 93T ,4 8h后收集假病毒上清 ,超离后通过Western blot证明HA蛋白能够在假病毒颗粒表面表达 ,表明HA能够整合到此病毒粒子表面。通过感染 2 93T、COS 7和NIH3T3三种不同的靶细胞 ,证实所构建的假病毒粒子具有感染性和泛嗜性。本研究成功构建了具有感染性的MuLV HA假病毒体系 ,为研究鹅源禽流感病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法。     

利用焦磷酸测序技术检测H7N9禽流感病毒NA基因分子标签

本研究旨在建立H7N9亚型禽流感病毒NA基因分子标签的焦磷酸测序检测方法,用于H7N9型禽流感病毒的快速检测和鉴定。通过对公开发表的H7N9亚型禽流感病毒NA基因序列进行比对,发现分离株在NA基因特定区域缺失的15个核苷酸可作为H7N9亚型禽流感病毒NA基因特异性的分子标签。通过设计覆盖此区域的特异性扩增引物和测序引物,建立了H7N9型禽流感病毒NA基因焦磷酸测序检测方法。基于NA基因特定缺失区域建立的焦磷酸测序技术能用于H7N9亚型禽流感病毒国内分离株NA基因的快速检测和鉴定,且具有较好的特异性和重复性。通过对3株H7N9亚型禽流感病毒分离株的检测,表明3株H7N9亚型禽流感病毒的NA基因均存在15个核苷酸缺失的分子标签。本研究建立的H7N9亚型禽流感病毒NA焦磷酸测序检测方法,可用于H7N9禽流感病毒的检测和鉴定。