一种基于塞姆利基森林病毒复制子的新型复制子载体

RNA复制子是能自主复制的病毒RNA。基于RNA复制子的表达载体和基因疫苗比常规真核表达载体和DNA疫苗具有更大的优越性。以塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的真核表达载体pSFV1为骨架 ,插入CMV立即早期启动子和SV40晚期Poly(A)信号 ,构建了一种完全基于DNA的复制型表达载体pSFV1CS ,将增强型绿色荧光蛋白基因EGFP插入其中 ,构建了重组质粒pSFV1CS EGFP ,通过转染 2 93T细胞 ,证实外源基因能在其中高效表达。该载体可用于表达真核蛋白和构建复制子载体疫苗。     

表达EGFP报告基因口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建

【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制子质粒连续转化、测序检验复制子载体的稳定性。Not I线性化的复制子FMDV-EGFP用脂质体介导法转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞后,不同时间段观察EGFP荧光表达情况。转染的细胞用流式、间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测该复制子载体的自主复制能力和口蹄疫病毒蛋白的表达情况。【结果】复制子质粒的连续转化及测序表明报告基因可以稳定存在。FMDV-EGFP复制子转染BSR/T7细胞3 h后在荧光显微镜下能够看到绿色荧光,EGFP荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续6 d以上。转染24 h后的细胞流式分析显示转染的细胞中有6.0%发出荧光,说明构建的复制子载体能够有效表达EGFP蛋白。另外,间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot方法也检测到该复制子RNA在BSR/T7细胞中能够进行自主复制,并且能够表达病毒的非结构蛋白。【结论】含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子的成功构建为进一步研究病毒复制、翻译机制及筛选抗病毒药物等奠定了坚实的基础。     

人呼吸道合胞病毒微型复制子的构建

摘要：【目的】构建RSV微型复制子（minireplicon）并进行功能学研究。【方法】构建含RSV病毒前导序列（Leader, genomic promoter, Le）、转录起始信号（gene start, GS）、多克隆酶切位点、转录终止信号（gene end, GE）和尾随序列(Trailer, antigenomic promoter, Tr)的基因片段GSGE,通过引入T7 RNA多聚酶（T7 RNA polymerase, T7 RNP）启动子、克隆入载体px8δT和插入增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）等多步操作,获得RSV微型复制子重组质粒px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP。同时构建可表达大蛋白（large protein,L）的质粒pcDNA3.1/L及表达转录延长/转录终止抑制因子（M2 ORF 1 protein,M2-1）的质粒pcDNA3.1/M2-1。通过脂质体法共转染RSV微型复制子质粒及四种RSV核壳体蛋白质粒至可表达T7 RNP的BSRT7/5细胞系,倒置荧光显微镜及流式细胞仪分析EGFP的表达情况。【结果】成功构建了px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP及pcDNA3.1/L和pcDNA3.1/M2-1,五质粒共转染BSRT7/5细胞,倒置荧光显微镜及流式细胞仪均观察到绿色荧光的表达。【结论】构建的RSV微型复制子具有转录和复制功能,将有助于进一步开展以RSV反向遗传操作为基础的RSV疫苗研究。     

核酸疫苗pcDNA3.1-EG95的构建及在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达

克隆细粒棘球蚴EG95基因cDNA并构建核酸疫苗pcDNA3.1-EG95。根据GenBank中细粒棘球蚴EG95基因序列(AF134378)设计引物并在上游引物起始密码子前加上Kozak序列(CCACC),提取细粒棘球蚴总RNA,RT-PCR扩增目的基因EG95cDNA,扩增片段克隆到pcDNA3.1(+)中构建重组载体pcDNA3.1-EG95后测序。重组质粒pcDNA3.1-EG95采用脂质体法转染绵羊胎儿成纤维细胞并用G418筛选,RT-PCR检测稳定转染细胞中目的基因的转录。测序结果表明克隆的目的基因包含了471bp的完整ORF并与载体连接正确。RT-PCR检测表明EG95基因在稳定转染的绵羊胎儿成纤维细胞中得到转录。成功构建pcDNA3.1-EG95核酸疫苗并可在绵羊胎儿成纤维细胞中转录目的基因,可进一步用于活体动物免疫研究。     

日本脑炎病毒(JEV)复制子表达载体的构建及其鉴定

在以往构建的JEV疫苗株SA14-14-2感染性克隆pBRkpn-JTF的基础上,构建了去除JEV结构区域基因(prM基因和E基因),保留非结构区域基因的复制子表达载体pCTCJEV、pCTMJEV,转染BHK-21细胞后,通过反转录PCR(RT-PCR)和间接免疫荧光实验(IFA)检测该载体的自主复制能力和蛋白表达情况,结果证实该载体在BHK-21细胞中能够自主复制并且表达非结构蛋白。进一步在该载体中插入报告基因EGFP,检测外源蛋白的表达情况,结果显示在转染复制子载体的24h后,荧光显微镜下能够看见绿色荧光蛋白的表达,阳性信号持续增强,能够维持10d左右,证实了构建的复制子载体pCTCJEV能够有效地表达外源蛋白,这为进一步建立以乙脑病毒复制子为基础的疫苗载体系统打下基础。     

共表达siRNA和hIL-12的新型乙肝多表位DNA疫苗的研究

目的 构建含有靶向乙肝表面抗原(HBsAg)基因的siRNA、乙肝复合多表位抗原基因和hIL-12共质粒表达的新型DNA疫苗,并在HepG2细胞中检测siRNA的效果以及各基因的表达。方法 设计并合成复合多表位HBV抗原基因,将其与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合克隆进真核表达载体pVAX1的多克隆位点中,同时将带CMV启动子的完整hIL-12表达单元克隆进载体的BspH I位点之间,再设计并合成乙肝siRNA表达单元,将其克隆进载体的Mlu I位点之间,得到真核三元共表达重组质粒pVAX1-siHB-HB-EGFP-hIL12。以该重组质粒瞬时转染人肝癌细胞系HepG2,通过EGFP的荧光标记观察多表位抗原的表达,以ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达,以rtPCR检测siRNA对HBsAg基因的沉默效果。结果 经酶切鉴定和测序证实共表达siRNA、hIL-12的HBV 多表位DNA疫苗构建成功。转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达;转染后48 h hIL-12的检出量为1 289 pg/mL细胞上清,72 h检出量为1 712 pg/mL细胞上清;转染后HBsAg表达量明显降低,证实siRNA效果良好。结论 成功构建乙肝复合多表位抗原基因与siRNA、hIL-12共质粒表达的DNA疫苗,并能在真核细胞中有效表达抗原与hIL-12基因,而且siRNA对HBsAg显示出明显的沉默效果。我们的工作为进一步研究该复合型DNA疫苗抗HBV的治疗效果打下基础。     

人乳头瘤病毒l6型E6-E7融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的构建人乳头瘤病毒l6型(HPV16)E6-E7融合蛋白真核表达载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E6-E7基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7,双酶切及测序鉴定。将质粒转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E6-E7基因在HeLa细胞中的表达。提取质粒免疫小鼠,利用免疫组化方法检测在其肌肉组织中的表达。结果成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7;在转染pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7的细胞中检测到HPV16 E6-E7基因。在免疫该质粒的小鼠肌肉组织中可以检测到该质粒的蛋白表达。结论成功的构建的了真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7,该载体能在HeLa细胞内以及小鼠骨骼肌细胞内有效表达。     

pcDNA3.1-Canstatin-3Flag真核表达载体的构建及转染HepG2细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1-Canstatin-3Flag载体并稳定转染肝癌HepG2细胞,检测canstatin在mRNA水平的表达。方法:胎盘中提取总RNA,RT-PCR法获得canstatinDNA,克隆至pcDNA3.1(-)载体中,并测序,重组质粒pcDNA3.1-Canstatin-3Flag转染肝癌HepG2细胞,G418筛选出稳定转染细胞,RT-PCR检测canstatin mRNA表达。结果:1.成功构建出pcDNA3.1-Canstatin-3Flag重组质粒;2.获得稳定转染pcDNA3.1-Canstatin-3Flag的肝癌HepG2细胞;3.发现转染后的肝癌HepG2细胞canstatin在mRNA水平比未转染细胞有明显的增强。结论:获得了稳定转染pcDNA3.1-Canstatin-3Flag的肝癌HepG2细胞,为后期canstatin在肝癌中的研究提供了支持。     

小鼠Uncv基因克隆及真核表达

目的 克隆小鼠的Uncv基因并在真核细胞表达.方法 采用RT-PCR方法扩增小鼠皮肤组织中Uncv基因编码区,以真核表达质粒pcDNA 3.1-Flag为载体,构建Uncv真核表达质粒,将重组载体转染Hela细胞并用Western blot法检测基因表达.结果 构建Uncv基因真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Unev,重组质粒在Hela细胞中有效表达约95×103的融合蛋白.结论 成功构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Uncv,并且在真核细胞中有效表达,为研究Uncv基因生物学功能奠定基础.     

人同源盒基因NKX3.1对前列腺癌细胞的诱导凋亡作用

构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC-3、LNCaP 中的表达及对细胞的促凋亡作用.以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT-PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,将NKX3.1 cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中; 将pcDNA3.1-NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC-3和LNCaP 细胞,用RT-PCR和Western印迹检测NKX3.1 cDNA在转录水平和蛋白水平的表达;绘制细胞生长曲线,观察NKX3.1对前列腺癌细胞增殖的抑制作用;用DNA/ladder和流式细胞术检测NKX3.1对前列腺癌细胞凋亡的影响,进一步用RT PCR检测凋亡相关基因caspase3、caspase8、caspase9、Apaf1、survivin和Bcl2表达的变化.人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1-NKX3.1经酶切及测序鉴定正确. pcDNA3.1-NKX3.1转染PC-3和LNCaP细胞后,经RT-PCR和Western印迹证明能有效表达NKX3.1.生长曲线显示,前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA后细胞增殖受到抑制;前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA 48 h后,DNA电泳呈现具有凋亡特征的DNA ladder;流式细胞术检测出现明显凋亡峰;RT-PCR检测凋亡相关基因.结果显示,caspase3、caspase8、caspase9基因表达明显增加,Bcl2基因表达明显减少.本研究成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1, 转染PC3和LNCaP细胞后能有效表达,并对细胞具有诱导凋亡作用     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

MAGE-3 DNA疫苗的构建及其免疫效果的观察

通过RT PCR方法扩增MAGE 3cDNA ,以pcDNA3 1+为载体 ,构建重组表达质粒pcDNA3 1 MAGE 3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞 ,经RT PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE 3的表达。以 10 0 μg质粒剂量肌肉注射接种小鼠 ,间隔 10天 ,共 3次 ,以空载体和PBS为对照。结果 ,重组质粒免疫的小鼠 ,其脾淋巴细胞对MAGE 3阳性靶细胞的杀伤活性为 51 0 8± 7 41% ,与空载体组 (8 44± 1 89% )及PBS组 (5 76± 1 75% )相比 ,差异有显著性 (P <0 0 1) ,而对MAGE 3阴性靶细胞的杀伤活性分别为 8 2 1± 1 65% ,7 68± 1 56%和 5 13±1 42 % ,其差异无显著性 ;MAGE 3DNA疫苗组免疫血清 1∶15稀释时能检测到抗MAGE 3抗体 ,脾细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN γ、IL 2水平明显升高 ,外周血中CD4+、CD8+T细胞也提高 ,小鼠肿瘤的生长速度明显减慢 ,与对照组相比 ,差异显著 (P <0 0 1)。说明MAGE 3重组质粒免疫小鼠可以诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答     

小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建及表达

克隆小鼠IL-33基因构建其真核表达质粒,并转染COS-7细胞检测其表达。提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA,经反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因,酶切后插入pcDNA^TM3.1/myc HisA构建其真核表达质粒pcDNA-3.1-IL-33,重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR和免疫印迹法（western blotting）检测目的基因表达。结果显示,pcDNA3.1-IL-33中插入的片段序列测定结果与小鼠IL-33cDNA序列一致,重组质粒转染COS-7细胞后检测到相应mRNA及蛋白表达。成功克隆了小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

Comparison of immune responses against FMD by a DNA vaccine encoding the FMDV/O/IRN/2007 VP1 gene and the conventional inactivated vaccine in an animal model

Foot-and-mouth disease virus (FMDV) is highly contagious and responsible for huge outbreaks among cloven hoofed animals. The aim of the present study is to evaluate a plasmid DNA immunization system that expresses the FMDV/O/IRN/2007 VP1 gene and compare it with the conventional inactivated vaccine in an animal model. The VP1 gene was sub-cloned into the unique Kpn I and BamH I cloning sites of the pcDNA3.1+ and pEGFP-N1 vectors to construct the VP₁ gene cassettes. The transfected BHKT7 cells with sub-cloned pEGFP-N1-VP1 vector expressed GFP-VP1 fusion protein and displayed more green fluorescence spots than the transfected BHKT7 cells with pEGFP-N1 vector, which solely expressed the GFP protein. Six mice groups were respectively immunized by the sub-cloned pcDNA3.1⁺-VP1 gene cassette as the DNA vaccine, DNA vaccine and PCMV-SPORT-GMCSF vector (as molecular adjuvant) together, conventional vaccine, PBS (as negative control), pcDNA3.1⁺ vector (as control group) and PCMV-SPORT vector that contained the GMCSF gene (as control group). Significant neutralizing antibody responses were induced in the mice which were immunized using plasmid vectors expressing the VP1 and GMCSF genes together, the DNA vaccine alone and the conventional inactivated vaccine (P<0.05). Co-administration of DNA vaccine and GMCSF gene improved neutralizing antibody response in comparison with administration of the DNA vaccine alone, but this response was the most for the conventional vaccine group. However, induction of humeral immunity response in the conventional vaccine group was more protective than for the DNA vaccine, but T-cell proliferation and IFN-γ concentration were the most in DNA vaccine with the GMCSF gene. Therefore the group that was vaccinated by DNA vaccine with the GMCSF gene, showed protective neutralizing antibody response and the most Th1 cellular immunity.     

核苷酸切除修复基因XPA反义RNA表达载体的构建及其抑瘤功能

采用RT PCR方法扩增出 4 2 6bp着色性干皮病A(xerodermapigmentosumgroupA ,XPA)cDNA片段 (2～ 4 2 7bp) ,反向插入pcDNA3 1质粒构建XPA反义RNA表达载体 .经测序证实 ,该片段序列与XPAmRNA对应片段完全互补 .通过脂质体Lipofectamine 2 0 0 0将重组质粒转染肺癌A5 4 9细胞 ,RT PCR检测表明转染XPA反义RNA重组质粒能够抑制肺癌细胞XPAmRNA表达 ;MTT实验表明转染XPA反义RNA的肺癌细胞对顺铂敏感性增强 .本研究为深入探讨NER途径基因功能及临床克服肿瘤耐药提出了一个新的思路     

T7噬菌体转运真核表达载体入胞表达平台的构建

[目的]构建携带锚定序列的真核表达载体,研究T7噬菌体识别、包裹和转运真核表达载体进入细胞实现蛋白表达的可行性,为DNA疫苗研发建立新的技术平台.[方法]本研究通过重叠延伸PCR方法获得候选锚定序列并插入真核表达载体;建立荧光定量PCR方法比较T7噬菌体识别、包裹真核表达载体的效率;激光共聚焦显微镜观察T7噬菌体转运真...     

HCV 5A基因在Hela细胞中的稳定表达及对细胞生长的抑制现象

应用PCR技术从含有HCV(Hepatitis Cvirus)全长开放阅读框的质粒pBRTM／HCV 1-3011中获得NS5A全长基因片断,利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3．1(-)中。通过酶切、PCR及测序鉴定NS5A基因已正确插入到pcDNA3．1(-)中,再利用脂质体介导转染Hela细胞,48h后传代并利用pcDNA3．1(-)质粒上的neo抗性基因加入G-418进行筛选。大约两周后,获得稳定表达的细胞株。经RT-PCR及western blot验证,证实HCV的NS5A基因在Hela细胞中已经获得了表达。在培养条件完全一致的条件下,表达NS5A基因的Hela细胞与pcDNA3．1(-)转染的细胞相比,生长速度明显变慢,其倍增时间约为35-36h,比对照组细胞增加了约50％,而转染pcDNA3．1(-)的细胞的倍增时间与正常Hela细胞则无明显差别,都为23-24h。从而证明HCV的NS5A蛋白具有抑制Hela细胞生长的作用。     

病毒负性调节因子在内皮细胞稳定表达细胞株的建立

建立HIV-1的调节基因Nef基因在内皮细胞稳定表达的细胞株ECV304-Nef,为研究Nef对血管内皮细胞生物学活性的影响奠定试验基础。构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Nef,将其质粒和pcDNA3.1(+)质粒(阴性对照)分别转染血管内皮细胞ECV304,G418筛选。通过RT-PCR检测NefmRNA在细胞中的表达;细胞免疫荧光法检测Nef蛋白的表达及定位;Western blotting检测Nef蛋白的特异性表达,获得稳定表达的细胞株。构建的重组质粒pcDNA3.1(+)-Nef经BamHI和EcoRI双酶切鉴定,得到的片段大小与理论值相符,分别为载体的5400bp和目的基因的621bp。测序结果显示碱基序列与GenBank(登录号:K03455)序列相同。转染细胞经G418筛选后获得稳定表达Nef的ECV304细胞株,RT-PCR显示转染pcD-NA3.1(+)-Nef质粒的ECV304细胞出现621bp条带,对照组无目的条带出现;荧光显微镜下观察转染pcDNA3.1(+)-Nef质粒的ECV304细胞表达的Nef蛋白主要定位于细胞质中。Western blotting结果显示,转染pcDNA3.1(+)-Nef质粒的ECV304细胞约27kD处检测到目的条带,表明pcDNA3.1(+)-Nef表达正确。     

人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。