人呼吸道合胞病毒M蛋白非复制型重组腺病毒的构建和鉴定

人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus, RSV)基质蛋白（matrix protein,M）在RSV形态发生上具有重要作用,因含有CTL抗原表位,在疫苗研究上具有一定意义。为此,应用RT-PCR 方法从感染RSV的HEp-2 细胞中扩增获得M蛋白基因,构建了含M基因的非复制型重组腺病毒并进行表达和鉴定。基因序列分析显示RSV M基因仅有一处碱基发生错义突变。非复制型重组腺病毒DNA分子FGAd/RSVM转染293细胞,观察到细胞出现CPE,RT-PCR发现M基因有转录,Western blotting及间接免疫荧光分析检测到M蛋白。成功克隆A亚型RSV Long株M基因,并获得一株可表达A亚型RSV M蛋白的非复制型重组腺病毒FGAd/RSVM,可用于体内研究观察其免疫效果及免疫保护作用。     

中国河北省卢龙地区猪札如病毒的基因多样性

Porcine sapoviruses (SaVs),which belong to the family Caliciviridae,have been considered potential zoonotic agents for human infection,and several cases have been reported in Asian countries. In this study,a total of 200 porcine fecal samples collected from Lulong county of China were tested. Among 200 samples,porcine sapoviruses were detected by RT-PCR in 17 samples (8.5%) showing their circulation in China. 14 out of 17 positive sapovirus strains were genetically related to the genogroup III (GIII) and we...     

人呼吸道合胞病毒RNA聚合酶复合体蛋白N、P的表达鉴定

本研究根据编码A亚型人呼吸道合胞病毒(HumanRespiratorySyncytialVirus,HRSV)核壳体蛋白(Nucleocapsidprotein,N)和磷蛋白(phosphoprotein,P)的基因序列,各设计一对特异性的引物,应用RT-PCR技术,从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得n和p的基因片断,克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )。获得的重组质粒通过脂质体Lipofectamine2000转染COS-7细胞,72h后再用Westernblot鉴定蛋白的表达。结果显示真核表达载体pcDNA3.1( )/N和pcDNA3.1( )/P的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变,利用蛋白印记方法也检测到了N和P的特异性条带。于是我们认为成功构建了含有HRSVN和P编码基因的真核表达载体,在真核细胞内能顺利表达。为进一步开展HRSV反向遗传学等研究奠定了基础。     

中国广西龙虎山野生猕猴粪便的病毒宏基因组学分析

非人灵长类携带的病毒种类繁多,其中部分对人具有致病性。为深入了解我国野生猕猴携带病毒的状况,本研究应用MiSeq高通量测序及生物信息学分析技术,对从广西采集的280份猕猴粪便标本进行了病毒宏基因组学的分析。高通量测序共获得了233 726 79条读长(Reads),其中4641条序列与病毒相关,进一步注释到27个病毒科(包含细小病毒科中的细小病毒亚科和浓核病毒亚科),包括其中5种脊椎动物病毒(占78.2%)、6种昆虫病毒(占5.5%)、11种植物病毒(占10.4%)、其他的病毒(占9.8%);遗传进化分析结果显示,被注释为萨佩罗病毒、肠道病毒、细小病毒、腺相关病毒等序列与已知病毒相似,部分序列呈现明显的差异;应用PCR扩增进一步证实了病毒序列的真实存在。本研究初步确定了广西地区猕猴粪便中病毒的病毒谱,为深入分析和研究其中有潜在公共卫生意义的病毒奠定了基础。     

人呼吸道合胞病毒微型复制子的构建

摘要：【目的】构建RSV微型复制子（minireplicon）并进行功能学研究。【方法】构建含RSV病毒前导序列（Leader, genomic promoter, Le）、转录起始信号（gene start, GS）、多克隆酶切位点、转录终止信号（gene end, GE）和尾随序列(Trailer, antigenomic promoter, Tr)的基因片段GSGE,通过引入T7 RNA多聚酶（T7 RNA polymerase, T7 RNP）启动子、克隆入载体px8δT和插入增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）等多步操作,获得RSV微型复制子重组质粒px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP。同时构建可表达大蛋白（large protein,L）的质粒pcDNA3.1/L及表达转录延长/转录终止抑制因子（M2 ORF 1 protein,M2-1）的质粒pcDNA3.1/M2-1。通过脂质体法共转染RSV微型复制子质粒及四种RSV核壳体蛋白质粒至可表达T7 RNP的BSRT7/5细胞系,倒置荧光显微镜及流式细胞仪分析EGFP的表达情况。【结果】成功构建了px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP及pcDNA3.1/L和pcDNA3.1/M2-1,五质粒共转染BSRT7/5细胞,倒置荧光显微镜及流式细胞仪均观察到绿色荧光的表达。【结论】构建的RSV微型复制子具有转录和复制功能,将有助于进一步开展以RSV反向遗传操作为基础的RSV疫苗研究。     

可表达人呼吸道合胞病毒融合蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建与制备

构建可表达A亚型人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和F蛋白的体外表达鉴定。将带有CMV启动子序列的F基因亚克隆至克隆载体pSC11,鉴定正确后,克隆至HDAd质粒pSC15B,构建pSC15B/F HDAd重组质粒,PmeⅠ消化pSC15B/F去除原核复制元件及抗性基因,获得HDAd/F DNA分子,经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞,16h后感染辅助病毒,收获HDAd/F载体粗提液,随后以HDAd/F粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至HDAd/F达到复制极限,同时以可表达β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)报告基因的HDAdLacZ载体作为平行对照监测载体复制过程。与辅助病毒共感染293Cre4细胞进一步扩增HDAd/F、CsCl梯度法超速离心制备大量纯化的HDAd/F载体,体外感染293细胞,RT-PCR检测到F基因有转录,Western blot分析表明F蛋白有特异性表达。总之,成功构建HDAd/F载体并在真核细胞中实现表达,为体内免疫学效力试验奠定基础,为研制RSV疫苗提供了一种新方法。     

人呼吸道合胞病毒感染的A549细胞中长链非编码RNA表达谱研究

目的:探讨人呼吸道合胞体病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)感染A549细胞的长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNA)表达谱的差异,更好地了解宿主与RSV之间的相互作用的可能分子机制。方法:1 MOI RSV感染A549细胞,24h后提取RNA,利用Agilent的lncRNA表达谱芯片,筛查了RSV感染和未感染的A549细胞中的lncRNA差异表达谱,并进行实时定量PCR验证,通过GO和KEGG对差异mRNA和lncRNA进行生物信息学分析。结果:RSV感染的A549细胞与未感染的A549细胞相比,共有1463个lncRNA和1552个mRNAs显著上调,有944个lncRNA和1489个mRNAs下调,差异表达lncRNA及其预测靶基因主要富集于免疫应答过程。通过定量PCR证实所选lncRNA的表达谱结果。结论:RSV感染A549细胞后,lncRNA表达谱发生明显变化,对深入研究lncRNA如何参与RSV与宿主之间的相互作用奠定了基础。     

G9型人A组轮状病毒LL52696与LL52727株的主要基因及其编码蛋白特征的分析

人A组轮状病毒(Human rotavirus,HRV)是引起世界范围婴幼儿重症腹泻的最主要病原,也是导致发展中国家婴幼儿死亡的主要病因之一[1-3],世界卫生组织统计每年大约引起611 000婴儿和儿童死亡,特别是发展中国家[4].HRV感染广泛,且改善营养状况和卫生条件对HRV发病危险影响不大,因此在发达国家和发展中国家HRV感染率接近.HRV引起的腹泻至今无特效药,发展疫苗对控制HRV感染的作用就显得特别突出.     

人呼吸道合胞病毒RNA聚合酶复合体蛋白N、P的表达鉴定

本研究根据编码A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,HRSV)核壳体蛋白(Nucleocapsid protein, N)和磷蛋白(phosphoprotein, P)的基因序列,各设计一对特异性的引物,应用RT-PCR技术,从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得n和p的基因片断,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).获得的重组质粒通过脂质体Lipofectamine 2000转染COS-7细胞,72 h后再用Western blot鉴定蛋白的表达.结果显示真核表达载体pcDNA3.1(+)/N和pcDNA3.1(+)/P的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变,利用蛋白印记方法也检测到了N和P的特异性条带.于是我们认为成功构建了含有HRSV N和P编码基因的真核表达载体,在真核细胞内能顺利表达.为进一步开展HRSV反向遗传学等研究奠定了基础.