3A蛋白104–115位氨基酸缺失口蹄疫A型标记病毒的构建

【目的】构建一株含3A非结构蛋白104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,分析其生物学特性和发展标记疫苗的潜力。【方法】采用融合PCR技术,在当前流行毒株A/Sea-97/CHA/2014全长感染性克隆p QAHN中引入3A104–115位氨基酸的缺失,构建全长重组质粒。全长质粒经NotI线化后转染表达T7RNA聚合酶的稳定细胞系,拯救标记病毒。RT-PCR、序列分析、间接免疫荧光和Western blotting鉴定标记病毒。噬斑表型和一步生长曲线分析标记病毒的生物学特性,并用实验室开发的针对3A优势表位(AEKNPLE)的阻断ELISA方法分析其区分亲本和标记病毒感染的动物。【结果】成功拯救到一株含3A 104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,3A表位的缺失没有影响标记病毒的噬斑表型和一步生长曲线。3A单抗阻断ELISA可以明显区分标记病毒和亲本病毒感染的动物。【结论】本研究构建的3A蛋白104–115位氨基酸缺失的标记病毒可以作为发展口蹄疫鉴别诊断疫苗的候选毒株,用于我国未来口蹄疫A型的有效防控。     

一种新型T细胞免疫原的原核表达及对口蹄疫疫苗的免疫增强作用

主要探讨了T细胞免疫原TI对口蹄疫疫苗的免疫增强作用。设计并原核表达产生了一种包含口蹄疫病毒VP1,VP4,3A和3D蛋白上多个T细胞表位与两个通用T细胞表位的T细胞免疫原,命名为TI;同时表达了O和Asia 1两个型口蹄疫病毒 VP1 蛋白的串联编码基因,表达产物命名为OA-VP1。将上述T细胞免疫原分别与OA-VP1和口蹄疫灭活疫苗按不同剂量组合免疫小鼠,于免疫后不同时间测定各组小鼠的体液与细胞免疫应答情况。采用微量中和试验检测小鼠O型和Asia1型中和抗体,采用流式细胞检测技术和测定γ-干扰素的水平来分析不同免疫组小鼠细胞免疫的水平。结果显示,与灭活疫苗或OA-VP1单独免疫组相比,添加TI抗原后灭活疫苗 (P＜0.01) 和OA-VP1免疫组(P＜0.05)小鼠均能产生高水平的特异性中和抗体;且CD4+ T细胞数量显著增多,IFN-γ产生水平显著升高 (P＜0.01)。说明TI抗原具有很好的诱导特异性体液与细胞免疫应答的作用,是一种很好的免疫增效剂,可作为口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中的一种有效成分,以提高疫苗的免疫效果。     

口蹄疫病毒O/CHN/Mya98/33-P株前导蛋白对病毒感染性的影响

【目的】研究口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)前导蛋白对于病毒感染性的影响。【方法】利用反向遗传操作技术,以O/CHN/93现用疫苗株的感染性克隆为骨架,分别构建了含口蹄疫病毒中国分离株O/CHN/Mya98/33-P和O/CHN/Mya98/HN1前导蛋白的两株嵌合全长cDNA感染性克隆,采用实时荧光定量PCR检测两株不同的嵌合病毒感染猪肾原代细胞后细胞内IFNβ和OAS mRNA的转录情况。【结果】嵌合病毒rOHN1Lab增殖能力较弱,其对应诱导产生的IFNβ和OAS mRNA含量较高,而嵌合毒rO33Lab相对于rOHN1Lab增殖能力较强,他们诱导产生的IFNβ和OAS mRNA含量较低。【结论】研究表明口蹄疫病毒中国分离株O/CHN/Mya98/33-P前导蛋白具有更强的抗IFNβmRNA转录的能力,该研究能够为进一步鉴定FMDV前导蛋白抗宿主先天性免疫的关键性位点奠定基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB双抗体夹心ELISA方法的建立

抗原纯净度是口蹄疫 (Foot-and-mouth disease,FMD) 灭活疫苗质量检验的一项重要内容,一般采用疫苗2–3次免疫动物后,检测非结构蛋白 (Non-structural protein,NSP) 抗体是否阳转,判断疫苗抗原的纯净度。文中旨在建立定量检测FMD灭活疫苗抗原中NSP 3AB含量的ELISA方法,为疫苗质量控制提供参考方法。利用口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus,FMDV) NSP 3A单克隆抗体和辣根过氧化物酶 (Horseradish peroxidase,HRP) 标记的3B单克隆抗体,建立定量检测NSP 3AB含量的双抗体夹心ELISA检测方法。采用原核表达并纯化的3AB蛋白作为标准品,标准品系列稀释,绘制标准曲线,以标准品与未加抗原的阴性对照吸光值 (OD) 的比值大于2.0的标准品最低浓度为最低检测限。标准品浓度介于4.7–600.0 ng/mL之间时,测得的OD值与浓度呈线性相关,回归曲线呈直线,相关系数R2=0.99,确定最低检测限为4.7 ng/mL。检测12份未纯化灭活抗原中3AB蛋白含量介于9.3–200.0 ng/mL之间;而纯化后的病毒抗原中3AB蛋白残留量低于最低检测限;33份来自不同厂家的成品疫苗抗原中9份疫苗抗原3AB蛋白含量在9.0–74.0 ng/mL之间,其余24份疫苗抗原中3AB蛋白残留量低于最低检测限。检测3AB蛋白含量的双抗体夹心ELISA方法能够特异、敏感地检测疫苗抗原中的3AB蛋白含量,为疫苗质量控制与纯净度检验提供了一种可供选择的检测方法。     

一起荷斯坦奶牛乳头瘤病诊断及其病毒基因型分析

牛乳头瘤病毒是一种能够引起牛发生皮肤乳头状瘤、纤维素瘤、膀胱和食道癌的DNA病毒,现已在牛群中广泛传播,对牛养殖业造成了重大经济损失.为了诊断甘肃某荷斯坦奶牛场300多头泌乳期奶牛乳头突发疣状物的病因,本研究采用流行病学调查、临床观察、组织病理学、分子生物学检测方法和基因测序技术,对患有疣状物的奶牛进行综合诊断.结果 表明,乳头患疣状物奶牛的其它部位无类似生长物,无发烧、疼痛等异常临床症状,组织病理学HE检测疣状物呈现角化过度和细胞空泡化现象,这与牛乳头瘤病毒感染的组织病理变化相似,并且用PCR方法获得了牛乳头状瘤病毒L1基因,测序比对结果显示为乳头瘤病毒7型基因,核苷酸同源性达98％以上.因此,本次荷斯坦奶牛乳头突发疣状物为乳头瘤病毒7型感染引起的,这是甘肃地区首次发现该基因型乳头瘤病毒,应引起奶牛场与防疫部门的重视.     

型内嵌合口蹄疫病毒全长感染性cDNA克隆的构建

【目的】近年来,O型口蹄疫的不断暴发严重危害了我国畜牧业的发展,其病原——O型口蹄疫病毒已演化出3种谱系:中国型猪毒系、泛亚系和缅甸98系。其中中国型猪毒系病毒高度嗜猪,对养猪业危害最大。目前应用的疫苗已不能有效保护中国型猪毒系变异株的流行,这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株,本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染性克隆为骨架,用流行的新猪毒系病毒的部分VP3和VP1基因(主要是替换VP1蛋白上的B-C环和G-H环)替换疫苗毒株的相应部分,构建了嵌合的FMDV全长cDNA克隆。【方法】线化的嵌合全长质粒和表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,体内转录拯救嵌合病毒。【结果】嵌合全长质粒转染BHK-21细胞36h后,出现明显的FMDV致细胞病变效应。对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察结果证实成功拯救到嵌合的FMDV。拯救的病毒乳鼠致病性试验结果表明该拯救病毒对乳鼠的致病力减弱。该嵌合病毒的成功拯救为研制口蹄疫新型疫苗等奠定了基础。     

口蹄疫病毒A／AKT／58株基因组全长感染性cDNA克隆的体内拯救

构建了两种口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）基因组全长cDNA克隆DTA／FMDV和pCA／FMDV,利用体外转录和体内转录方法制备感染性病毒,并对其抗原性,乳鼠毒力（LD50）和病毒生长动力学等生物学特性进行了分析。为了鉴别野毒与重组病毒,利用融合PCR技术在两种全长cDNA基因组内分别引入了几个点突变（pTA／FMDV;T1029G,pCA／FMDV：A174G,A308G,T1029G）作为遗传标记。结果表明,两种重组病毒对3日龄乳鼠均表现致病性。但是由pTA／FMDV合成的感染性体外转录本RNA的毒力较弱（10^-6）;而与pCT7RNAP质粒共转染的pCA／FMDV体内拯救病毒的毒力较强（10^-7.5）,并在BHK-21细胞上表现出与野毒相似的生长特性。这一结果表明,在FMDV的拯救过程中,以pCT7RNAP为基础的体内拯救系统相比体外转录方法更为简便、实用。该系统为利用反向遗传操作技术深入研究FMDV的分子致病机制及其准种特性等奠定了良好的基础。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1容忍外源标签的能力

【目的】利用口蹄疫病毒的反向遗传操作技术,构建含不同外源标签口蹄疫病毒的全长克隆,鉴定口蹄疫病毒结构蛋白VP1容忍不同外源标签的能力。【方法】通过融合PCR技术,在FMDV O/HN/93全长感染性克隆的VP1 G-H环分别引入V5、TC12、KT3、3FLAG外源标签,构建全长质粒。全长质粒经Not I线化后转染表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞,拯救重组病毒。RT-PCR、序列测定、间接免疫荧光鉴定病毒,噬斑和一步生长曲线分析重组病毒的生物学特性。【结果】成功拯救到表达V5或KT3表位标签的重组病毒,未能拯救到表达TC12或3×FLAG的重组病毒。V5和KT3表位标签的插入均影响了口蹄疫病毒的复制能力。【结论】重组口蹄疫病毒的成功拯救为未来标记疫苗以及口蹄疫病毒作为表达载体等的研究奠定了基础。     

VP3 G–H环中氨基酸突变对O型口蹄疫病毒生物学特性的影响

【目的】为了研究O型口蹄疫病毒VP3G–H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响。【方法】借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHN~(V3174Y)和rHN~(D3173N+V3174E+N3179C)。进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID_(50)和LD_(50)的测定、间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜检测。【结果】结果显示,与骨架病毒rHN相比,虽然rHN~(V3174Y)和rHN~(D3173N+V3174E+N3179C)对BHK-21细胞的感染性及其蚀斑表型和复制动力学无显著性差异;但rHN~(V3174Y)和rHN~(D3173N+V3174E+N3179C)对乳鼠的致病力明显减弱,且均获得了小窝蛋白介导侵染CHO-K1细胞的能力。【结论】VP3上第3174位特征性氨基酸突变影响O型口蹄疫病毒感染宿主细胞的毒力及其内吞作用路径,这有助于我们认知VP3 G–H环在口蹄疫病毒粒子立体空间构象中潜在的作用。     

含RGD受体结合位点口蹄疫病毒Asia1/JS/China/2005株的拯救及初步鉴定

摘要：【目的】构建含有RGD受体结合位点口蹄疫病毒（FMDV）Asia1/JS/China/2005株的全长感染性cDNA克隆。【方法】采用定点突变方法,构建Asia1型FMDV含有预期突变的全长cDNA克隆pFMDV-RGD。pFMDV-RGD重组质粒经NotI线化后,与表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,进行FMDV-RGD病毒拯救。【结果】序列测定结果表明成功构建了FMDV含有RGD受体位点的Asia1/JS/China/2005全长cDNA克隆。共转染实验获得拯救病毒,对拯救的病毒分别进行序列测定、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析,表明成功拯救了含有RGD受体结合位点的Asia1/JS/China/2005株FMDV。【结论】该实验为进一步研究含有RGD和RDD受体结合位点2个拯救病毒生物学特性的差异奠定了基础。