米曲霉在产脱氨酶过程中的超微结构动态

腺苷酸脱氨酶(AMP deaminase,EC 3.5.4.6)催化5′-腺苷酸脱氨生成5′-肌苷酸。核酸经5′-磷酸二酯酶降解后,用AMP催化其中5′-腺苷酸使其生成5′-脱苷酸。产脱氨酶高活力米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)AS3.800,在制作麸麯过程中,当米曲霉分生孢子颜色由浅黄变为绿色时,酶活力下降。现对培养1.5、2、2.5及3天的麸麯进行了电镜观察与脱氨酶     

用GAP启动子在Pichia pastoris GS115中组成型表达鼠灰链霉菌腺苷酸脱氨酶

【目的】构建产AMP脱氨酶的重组毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)菌株,并初步优化其发酵条件。【方法】以鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)基因组为模板PCR扩增获得腺苷酸脱氨酶基因AMPD,以pGAP9K为载体构建重组表达质粒pGAP9K-AMPD并通过电转化法转入Pichia pastoris GS115,筛选转化子对其酶活进行测定,并初步优化其发酵条件。【结果】构建了毕赤酵母重组菌,通过分光光度法测定,显示重组菌有明显的酶活;初步优化发酵条件为:该重组菌最适发酵培养基为:甘油2%,蛋白胨2%,酵母膏1%,KH2PO40.5%,MgSO4·7H2O0.05%,pH 6.0;发酵条件为:接种龄24 h,转接量3%,30°C﹑200 r/min培养96 h,取发酵上清液测定酶活,重组菌腺苷酸脱氨酶酶活达到2 230±60 U/mL。【结论】构建了一株产AMP脱氨酶活性较高的重组毕赤酵母菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到2 230±60 U/mL。为AMP脱氨酶工业化生产奠定了一定的基础。     

腺苷酸脱氨酶在乳酸克鲁维酵母中构建表达

【目的】实现鼠灰链霉菌来源经密码子优化后的腺苷酸脱氨酶基因在乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis GG799)中组成型表达。【方法】以鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)来源的腺苷酸脱氨酶(AMP)基因经密码子优化后作为模板,设计特异性引物,PCR扩增AMP脱氨酶基因opt-AMPD,以p KLAC1为载体构建重组表达质粒p KLAC1-opt-AMPD,经Sac II线性化后电转化法转入K.lactis GG799,筛选得到重组菌株,测定酶活,经His TrapTM HP纯化后得到AMP脱氨酶,并优化重组菌的发酵培养基。【结果】对AMP脱氨酶基因进行了密码子优化后,构建了重组K.lactis GG799/p KLAC1-opt-AMPD,实现组成型表达,密码子优化后AMP脱氨酶酶活提高到586±50 U/m L。SDS-PAGE结果显示,纯化后的AMP脱氨酶为单一条带,蛋白大小约为60 k D。优化的发酵培养基为(g/L):葡萄糖40、蛋白胨20、酵母粉15、Na Cl 8、KCl 10、Mg SO4 2,30°C、200 r/min发酵120 h,酶活达到2 100±60 U/m L。【结论】实现了密码子优化后的腺苷酸脱氨酶基因在乳酸克鲁维酵母GG799内的组成型表达,为实现腺苷酸脱氨酶的重组高效表达和发酵生产进行了有益探索。     

固态发酵生产腺苷酸脱氨酶

对多株曲霉产腺苷酸脱氨酶的性能进行了比较,发现米曲霉3.800(Aspergillus oryzae)产酶水平较高。该菌株固态发酵产酶的适宜培养基为：以麸皮为主原料,蔗糖2％,鱼粉2％,（NH4）2SO4 0．1％,柠檬酸钠0．2％,MgSO4 0.05%,吐温－80 0．1％,含水量50％。最佳的培养条件为：250mL三角瓶装20g培养基,在28－30℃培养60h。在优化条件下,培养物酶活可达到1543．48u/g鲜曲。     

一种快速可靠的3’,5’-cAMP 磷酸二酯酶活力测定法

磷酸二酯酶(PDE; E.C.3.1.4.17.)催化cAMP分解为5′-AMP,它与质膜上催化cAMP生成的腺苷酸环化酶配合,共同控制细胞内cAMP含量.因此,观察PDE活力变化对于研究环腺苷酸在细胞代谢调控中的作用具有重要意义.PDE活力测定多采用放射性同位素标记的cAMP为底物.由于一般粗酶样品中同时存在多种5′-核苷酸酶,使5′-AMP分解而引起误差,因此常将经PDE作用后生成的5′-AMP转化为腺苷测定.基本反应如下.3′,5′-cAMP 5′-AMP 腺苷 Pi     

大白鼠腹腔巨噬细胞2''''-5''''寡腺苷酸合成酶

干扰素(IFN)或干扰素诱导剂能激活巨噬细胞,提高巨噬细胞的吞噬活力。不同来源的巨噬细胞,在体外培养条件下,用pppA2′p5′A2′p5′A(2′-5′P_3A_3)短时间刺激之后,吞噬活力也明显提高。但这两种作用之间有何关系,目前仍不清楚。因为2′-5′P_3A_3是寡腺苷酸合成酶(Esi)利用ATP合成的寡聚腺苷酸中的一种(它     

紫外诱变选育米曲霉高产蛋白酶菌株

以从自然发酵黄豆酱中筛选的5株野生米曲霉为供试菌株,以这些菌株产蛋白酶(酸、中、碱)、淀粉酶(α-淀粉酶、糖化酶)活力大小为评价标准,筛选出米曲霉K61作为诱变出发菌株。采用紫外诱变对米曲霉K61菌株进行改造,最终筛选出一株蛋白酶活力高且遗传性能稳定的突变株Y29。将米曲霉Y29菌株应用于黄豆酱的生产中,并与目前工业生产中广泛应用的米曲霉沪酿3.042菌株进行比较。性能实验结果表明米曲霉Y29菌株的蛋白酶(酸、中、碱)活力明显高于米曲霉沪酿3.042菌株,但α-淀粉酶、糖化酶、生长速度和孢子数这4个指标两者的差异并不显著;制酱品质试验结果表明,米曲霉Y29菌株的酱香更浓郁一些,氨基酸态氮含量达到0.77g/100mL,高于米曲霉沪酿3.042菌株,其它指标均符合国家标准GB2718-1996。     

丙氨酸脱氢酶研究概况

丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase,ALD,EC 1.4.1.1)是一种以烟酰胺腺嘌呤(NAD)为辅酶的氨基酸脱氢酶.丙氨酸脱氢酶可逆催化丙氨酸氧化脱氨生成丙酮酸、氨及NADH.丙氨酸脱氢酶也是调节氨基酸代谢和糖代谢的重要酶类,其催化反应的产物丙酮酸广泛应用于医药、农药和食品等领域,具有良好的发展前景.主要介绍丙氨酸脱氢酶的纯化及活力检测、酶空间结构(底物结合住点),以及催化反应机理等方面的研究.     

中性蛋白酶高产菌株的筛选及产酶酶系分析

目的:满足水产中对中性蛋白酶的需求。方法:以实验室保藏的米曲霉ZW为出发菌株,经Co60定向诱变,通过透明圈法初筛、摇瓶发酵复筛,筛选中性蛋白酶活力高的菌株,并对其进行产酶酶系分析。结果:筛选到的米曲霉ZW-06产中性蛋白酶酶活可达15000U/g干曲,比诱变前酶活提高了74%,是目前国内报道的固体发酵产中性蛋白酶活力最高的菌株;经过10代传代之后,酶活力仍保持稳定。通过对米曲霉ZW-06进行产酶酶系分析,发现发酵产物中除了有较高的中性蛋白酶酶活,还有较高的木聚糖酶和酸性纤维素酶酶活,酶活分别达到49879U/g干曲和21099U/g干曲。结论:米曲霉ZW-06在饲料工业中有很大     

生物催化氨基酸C—N裂解反应的研究进展

氨基酸脱氨酶能催化系列氨基酸C—N裂解反应生成对应的α 酮酸和氨,是代谢途径及生物催化的重要酶.综述了近年来催化氨基酸C—N裂解反应的5'磷酸吡哆醛介导的苏氨酸脱氨酶、黄素腺嘌呤二核苷酸介导的L氨基酸脱氨酶和L氨基酸氧化酶,以及这些关键酶应用于多酶级联反应中以生产α 羟基酸、α 酮酸、D氨基酸等精细化学品的研究进展.此...     

国外大刊重要论文简介

改变腺苷酸库的结果导致转基因植物 ①淀粉含量和产量增加RegiererB ,FernieAR ,SpringerF ,Perez_MelisA ,LeisseA ,KoehlK ,WillmitzerL ,GeigenbergerP ,KossmannJNatureBiotechnology ,2 0 0 2 ,2 0 :1 2 5 6～ 1 2 60淀粉及其精细加工产品作为人类日常饮食的重要来源。植物合成淀粉主要在质体中进行。研究发现 :增加质体腺苷酸的供应可以有效提高淀粉含量。腺苷酸激酶 (EC2 .7.4.3)主要催化ATP和AMP向ADP的转化 ,因此可以有效地调控质体腺苷酸的水平。采用反义RNA对该酶基因的下游调控对质体各种腺苷酸的量均有影响。借…     

用毛霉生产核苷酸类衍生物I．利用毛霉酶促合成三磷酸腺苷

由76株霉菌(其中包括曲霉8株,根霉13株,毛霉38株和其它霉菌17株)中,筛选出8株毛霉,它们由AMP酶促台成ATP的转化率在90％以上,其中5株的转化率在95％以上。根据紫外吸收光谱,纸上电冰谱及酸不稳定磷测定结果,确证AMP酶促合成产物是ATP。在酶反应液中加入碘乙酸和氟化钠,强烈抑制ATP的合成;加入a, a’一联吡啶、丙二酸、叠氮化钠、2,4一二硝基酚和对ATP的合成没有或只有做弱的抑制作用;磷酸三钠,可促进ATP合成;同时反应过程中释放二氧化碳和生成乙醇,因此,这些毛霉菌株主要是通过糖酵解过程由AMP合成ATP的。     

产α-淀粉酶的米曲霉菌株筛选及产酶条件的研究

从51株米曲霉(Aspergillus oryzae)中筛选到5株产α-淀粉酶活力较高的菌株,对其中的5037号菌株进行了产酶条件的试验:最适培养温度为30—33℃,时间为2.5天,3天以后酶活力开始下降;pH3.5—6.0之间对产酶活力影响均不大;外加碳源以糊精和瓜干粉较好,其中玉米粉加量以5%最好;外加氟源中NH₄NO₃和尿素等对酶的形成有促进作用;NH₄Cl抑制酶的形成。在最适产酶条件下,酶活力平均达438.8u/ml。     

苯丙氨酸脱氨酶cDNA在大肠杆菌中的克隆与表达及酶法合成L-苯丙氨酸

利用基因重组技术 ,在大肠杆菌中克隆并表达苯丙氨酸脱氨酶 (PAL) (EC4 .3 .1 .5) ,并应用此酶转化肉桂酸生成L 苯丙氨酸。方法是将欧芹苯丙氨酸脱氨酶cDNA亚克隆到组成型表达载体pMG3 6e启动子P3 2下游 ,以菌落PCR法鉴定插入片段的大小和方向都正确的克隆 ,进而以HPLC检测肉桂酸浓度的方法鉴别重组质粒有催化肉桂酸生成L 苯丙氨酸的酶活力。结果获得能表达PAL酶活性的阳性克隆 ,在pH1 0 ,含 1 .0 %肉桂酸、8.0mol/L氨的转化液中 ,3 0℃反应 2 0h ,肉桂酸重量转化率可达 60 %。该基因工程菌有希望用于工业化生产L 苯丙氨酸。     

pppA2′p5′A2′p5′A保护病毒感染细胞的普遍性

pppA2′p5′A2′p5′A(简称2′-5′P_3A_3)是干扰素作用于细胞后诱导产生的物质。干扰素的作用机理很复杂,其中之一是2′-5′寡聚腺苷酸合成酶的活力增加,此酶以ATP为底物合成2′-5′P_3A_3及其同系物2′-5′P_3An。但2′-5′P_3A_3或2′-5′P_3A_n本身是否具有抗病毒作用,干扰素的抗病毒作用是否通过2′-5′P_3A_3或2′-5′P_3A_n而进行,这是一个很     

米曲霉6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因gsdA的克隆及生物信息学分析

6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖酸,并生成NADPH,是微生物胞内磷酸戊糖途径（PPP）的关键酶。本研究以食品安全菌米曲霉CICC2012为材料,克隆获得6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(GenBank登录号：JN123468)。序列分析表明,该酶是由222个氨基酸组成的亲水性蛋白;128～134位氨基酸序列DHYLGKE为活性区域;170～176位氨基酸序列GTEGRGG可能为辅因子结合位点。进化树分析表明,米曲霉6-磷酸葡萄糖脱氢酶同其他丝状真菌及酵母的G6PDH较相似。     

蛇足石杉内生真菌产黄青霉菌MT-40中xanthocillin类似物生物合成基因簇的挖掘及鉴定

Xanthocillin具有显著的抗菌活性,结构中含有独特的异腈基。本文通过对蛇足石杉(Huperzia serrata)内生真菌产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)MT-40基因组的测序分析,利用本地BLAST等生物信息学分析工具挖掘具有合成xanthocillin类似物潜力的基因簇,结合米曲霉(Aspergillus oryzae)NSAR1异源表达技术实现基因簇中关键基因的功能鉴定。结果成功从内生真菌P.chrysogenum MT-40中发现一个合成xanthocillin类似物的生物合成基因簇(命名为for),for基因簇中的关键生物合成基因forB编码的异腈基合成酶可以催化合成2-formamido-3-(4-hydroxyphenyl)acrylic acid,基因forG编码的P450酶可以催化2-formamido-3-(4-hydroxyphenyl)acrylic acid的二聚化生成xanthocillin类似物N,N′-(1,4-bis(4-hydroxyphenyl)buta-1,3-diene-2,3-diyl)diformamide。本文研究结果为进一步从真菌中发现xanthocillin类似物提供参考。     

右旋糖酐酶产生菌的筛选及其酶学性质的比较研究

从3162株真菌中筛出具有右旋糖酐酶话力的菌株528株,其中黄柄白曲霉(Asp. Flavi-pes)、蠕形青霉(Pen. Vermiculatum)、产黄青霉(Pen. Chrysogerum)和构巢曲霉(Asp. Nid-ulans)也产该酶,这在文献中尚未见报道。通过复筛,从中选出5株,它们分属黄柄白曲霉(Asp. Flavipe、二株)、肉色曲霉(Asp.carneus)、焦曲霉(Asp. Ustus)和淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)(各一株)。对它们的产酶特性作了一系列比较研究,发现所有酶的最适温度皆为50--55℃,最适作用PH为5.0—5.5,酶解最终产物是异麦芽塘、异麦芽三糖及少量葡萄糖,故它们皆属内切型右旋糖酐酶。此外它们在温度和PH稳定性、其它酶活力存在的情况、对不同底物作用的情况、凝胶电泳模式、金属离子和一些蛋白质变性剂的影响等方面都有一些差异。通过比较发现,由淡紫拟青霉8523菌产生的右旋糖酐酶具有较好的酶学性质：它在50"0保温24小时和60℃保温1小时,剩余话力分别为95％和90％,在pH 3．5—1 0．5很宽的范围内是稳定的,此外它对SDS和脲的耐受性也较其它菌株的酶好。     

产氨基酰化酶米曲霉高产菌株的选育

采用亚硝基瓜抑菌圈法对米曲霉菌株3042,AF92011,AF93018,AF93020,AF93022,AF93332进行诱变处理,从诱变菌株中筛选到几个高产氨基酰化酶菌株(3042-5,AF93020-2,AF93020-6和AF93022-5),对DL-蛋氨酸的拆分活力分别比出发菌株提高34.1%、157.6%、152.4%和145.4%,其中米曲霉菌株3042的诱变菌株3042-5最高酶活力达203.1U/ml     

人血液淋巴细胞脱氧胞嘧啶核苷酸脱氨酶的别构协同效应动力学研究

脱氧胞嘧啶核苷酸脱氨酶(dCMP脱氨酶)是一种催化dCMP水解脱氨生成dUMP的别构酶。我们从人血液淋巴细胞中提取出dCMP脱氨酶,并对酶的活性予以放射性同位素测定。本文对实验结果进行数学分析发现,象dCMP脱氨酶这样的正协同效应别构酶并非不遵守米氏方程式。此酶动力学作图的表观复杂性实际上是遵守米氏方程式的两种构象(R型和T型)的综合表现。虽然每种构象的K_m值(K_R和K_T)是其特性常数,但整个酶的表观K_m值却处于不断变化之中,随底物浓度的增加而急骤地降低。