Pseudomonas putida S1海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的克隆表达

利用PCR和TA克隆方法扩增和克隆得到了恶臭假单胞菌Pseudomonas putida S1的海藻糖合成酶基因treS.对其进行序列分析表明,其编码区含有2067bp,编码含688个氨基酸残基的蛋白质,其核苷酸序列和蛋白质序列与来源于其它假单胞菌属细菌的海藻糖合成酶的序列表现出了较高同源性.将该基因序列与表达载体pQE30T连接,构建重组质粒pQE30T-TS,并将其转化至E.coli M15菌株中.重组菌株经诱导表达后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示有明显的分子量约77.5kD的特异蛋白条带出现.经测定酶活力达19U/mL,约是原始菌株P.putida S1的50倍.     

在线推定和控制葡萄糖浓度改善谷氨酸发酵性能

谷氨酸发酵过程一般需要定时、人工分批式地添加葡萄糖。该流加操作方式会引起发酵罐内葡萄糖浓度的剧烈波动, 不利于高效、稳定的谷氨酸生产。谷氨酸发酵具有显著的非增殖耦联特征, 产酸期葡萄糖耗量与氨水耗量存在非常明显的关联性。通过在线计量氨水耗量推定糖耗以及葡萄糖浓度, 可比较准确地将谷氨酸发酵产酸期的糖浓度控制在预先设定的水平。当糖浓度控制在5 g/L~10 g/L的低水平时, 最终谷氨酸浓度可以达到80 g/L的较高水平, 高糖浓度下的渗透压效应有望得到缓解, 有利于发酵生产的稳定。     

一株转化淀粉或麦芽寡糖生成海藻糖的菌株D-97鉴定

由东北大田采集的土样中筛选到菌株D 97,该菌株胞内酶可以利用淀粉或麦芽寡糖合成海藻糖。通过生理、形态、结构特征分析及 1 6SrDNA基因全序列与参比菌株的序列比较 ,菌株D 97与食尼古丁节杆菌的 1 6SrDNA序列同源性高达 97 98% ,故将该菌株命名为食尼古丁节杆菌D 97(ArthrobacternicotinovorusD 97)。我们还将D 97菌株与日本林原公司的海藻糖生产菌———节杆菌Q36的有关生理生化特征进行了比较。     

谷氨酸生产菌S9114中的谷氨酸脱氢酶的研究

谷氨酸脱氢酶 (GDH)是谷氨酸生物合成的关键酶 ,谷氨酸棒杆菌S91 1 4是目前我国味精工业应用最广泛的生产菌种 ,其谷氨酸脱氢酶的研究尚未见报道。分离纯化该菌中的谷氨酸脱氢酶 ,研究其辅酶组成 ,对揭示谷氨酸脱氢酶的分子结构和性质 ,提高谷氨酸产率很有必要。将培养至对数期中期的细胞离心收集并用含适量DTT、ED TA的Tris_HCl缓冲液 (pH 7 5 )洗涤 ,用Frenchpressurecellpress破碎 ,离心去除菌体碎片得无细胞抽提液。然后使用 KTA_10 0快速纯化系统经DEAE_纤维素柱、疏水柱 (HIC)、G_2 0 0凝胶过滤柱层析得到纯化大约 70倍的以NAD PH为辅酶的GDH和部分纯化的以NADH辅酶的GDH。这两个酶分别对NADPH、NADH高度专一 ,不能相互代替。经HPLC和SDS_PAGE测得前一种酶的分子量和亚基分子量分别为 188kD和 32kD ,表明该酶为具有相同亚基的六聚体。酶活性测定使用HITACHIU_30 0 0分光光度计利用NAD(P)H在 340nm氧化的初速度进行。蛋白质含量测定利用Bradford方法进行 ,并以牛血清白蛋白为标准蛋白。纯化结果表明S91 1 4中确实存在两种GDH ,其中以NADH为辅酶的GDH尚未见报道。和某些具有两种GDH的微生物一样 ,S91 1 4可能也是以NADPH为辅酶的GDH参与谷氨酸的合成代谢 ,以NADH为辅酶的GDH参与谷氨酸的分解代谢。     

生物柴油耦联丙酮丁醇发酵的初步研究

以4种生物柴油(原料为地沟油、菜籽油、棕榈油和废肯德基油)作为萃取剂,开展了丙酮丁醇静态萃取发酵。通过分析发酵过程中的产气量及发酵40 h后油水两相中的溶剂浓度,发现生物柴油对丙丁梭菌有毒性。另外,静置条件下丁醇在不同油水两相中的液液平衡系数大致相同。在发酵24 h时加入棕榈生物柴油(油水体积比为0.4∶1),丁醇发酵强度达到最大值0.213 g.(L.h)-1、比对照(传统发酵)提高10.9%,且生物柴油中的丁醇质量浓度达到6.44 g.L-1。     

混合碳源发酵生产头孢菌素C过程优化

本文对头孢菌素C（Cephalosporin C,CPC）发酵过程中碳源补料控制策略进行了优化研究,提出了一种基于DO—Stat的混合碳源流加策略,提高了发酵整体性能。在7L发酵罐上对使用该策略和传统补油策略的头孢菌素发酵性能进行比较,结果表明,采用补加混合碳源（葡萄糖＋豆油）策略时,CPC终浓度最高,达到36．99g／L,CPC得率也从使用传统单纯补油策略时的11．39％提高到22．19％,代谢副产物去乙酰氧头孢菌素C（DAOC）的积累量少,DAOC／CPC只有0．38％,达到生产要求。     

海藻糖降解酶抑制因子的研究

研究了一系列因素对食尼古丁节杆菌D-97胞内海藻糖降解酵的抑制作用,发现有效霉素(井冈霉素)和乙酸能有效抑制海藻糖降解酶的活性,抑制率最大分别达到87．13％和85．16％．同时研究了它们对海藻糖转化率的影响,发现有效霉素能提高海藻糖转化率,最大增幅达17．44％,而乙酸却降低了转化率。     

毕赤酵母GS115表达HSA-GCSFm的诱导工艺研究

本文探讨了甲醇流加控制、添加胰蛋白胨和甲醇/山梨醇共混诱导对重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-HSA-GCSFm表达HSA-GCSFm的影响.结果显示:甲醇供应充足条件下HSA-GCSFm表达水平仅为37 mg·L-1,而甲醇添加受限条件下HSA-GCSFm表达水平可达到239mg·L-1;甲醇添加受限并添加胰蛋白胨条件下,HSA-GCSFm表达水平可以提高到266 mg·L-1;在此基础上,流加山梨醇作为辅助碳源,表达水平可大幅提高至424 mg·L-1.通过对各诱导条件下OUR、胞外蛋白酶及碳流分配进行分析后发现,将甲醇限制在低浓度同时添加胰蛋白胨与山梨醇,可以改善细胞代谢活性,增加细胞用于HSA-GCSFm合成的碳流分配量,降低胞外蛋白酶活性,从而提高了HSA-GCSFm的表达水平并缓解了HSA-GCSFm的降解.因此,该诱导工艺适于毕赤酵母高效表达HSA-GCSFm.     

Aspergllus usamii B_1及B_(1—12)果胶酶性质、组分和应用的比较研究

B_(1—12)是由Asp·usamii B_1经NTG、UV、LiCl复合处理选育到的一株呈黑色的孢子是适于液体培养的高酶活果胶酶菌株。具有发酵周期短、易过滤等痔点,酒樁沉淀的酶制剂与B_1比较,酶作用的最适pH分别为4.0和4.5,最适温度均力50℃,但在30℃时,B_1仍保持较高酶活水平的稳定性。B_(1—12)果胶酶组分ex—PG酶活高于B_1 0.5—1倍左右,endo—PG和PE变化不明显.两者都含有糖化酶、纤维素酶、蛋白酶、花青素酶等非果胶酶组分,其中糖化酶活性比B_1下降一倍.应用于苹果醋、苹果汁、草莓汁、樱桃汁的澄清.B_(1—12)优于B_1,透光率可达90%以上,但对枣汁的澄清效果却次于B_1。