生物素标记寡核苷酸探针探测扩增的病理性突变珠蛋白基因

用末端转移酶催化生物素核苷酸底物(Biotin-ll-dUTP)共价连接在合成的寡核苷酸3’羟基末端,从而合成了两种寡核苷酸探针(β~T_(41-42)及β~A_(41-42))。用它们分别与克隆化扩增的正常和突变的β—珠蛋白基因片段杂变。结果表明该探针都具有与~(32)P探针相似的特异性,其杂交的灵敏度为2—3pg(特异序列)。进而将探测HbS基因的正常和异常两种寡核苷酸19聚体(β~A_6和β~S_6)用~(32)P和生物素分别标记;将HbS杂合子病人的白细胞DNA经聚合酶链反应(PCR)法扩增,并以含正常β—珠蛋白基因的DNA片段作对照,与两种探针分别进行斑点杂交。所得结果完全一致;Hbs杂合子DNA对正常和异常探针都显出杂交信号,而正常DNA只与β~A探针显杂交信号。     

重组人FLT3配体的克隆、表达及功能鉴定

通过克隆人FLT3配体(rhFL)基因,建立其原核高效表达系统,为大规模获得rhFL产品,促进干细胞体外扩增移植等新技术在临床的应用创造条件。分离人外周血单个核细胞,提取总RNA,采用RT-巢式PCR扩增可溶型FL基因,以双脱氧终止法进行DNA序列分析;将目的基因与pProEXHT载体连接,重组体引入大肠杆菌并在IPTG诱导下表达;亲和层析纯化表达产物,观察其刺激CD34⁺细胞增殖的情况。从人外周血单核细胞中克隆得到长481bp的rhFL基因,测序结果与已知人FL基因序列一致;rhFL的表达量约占菌体蛋白总量的15%,经亲和纯化纯度达90%以上;rhFL⁺G-CSF⁺EPO刺激CD34^＋细胞增殖约400倍。获得了rhFL基因及其在大肠杆菌中的高效表达,初步建立了产物纯化途径,纯化后的rhFL具有较强的刺激造血干/祖细胞增殖的能力。     

·读作审编·《生物化学与生物物理进展》编辑部,亲爱的编辑同志:

根据本文第一作者提出的自抽连续离心原理,我们研制成自抽连续液/液离心分离机。 该机主要由驱动电机、转子、容器、机身及转速控制部分组成。容器上有进液槽、溢流槽、重液和轻液收集槽等。 转子外径为φ200mm,最大离心半径R=75mm,分离腔高h=36mm。 工作特点 该机适于在一段时期内分离同样样     

《生物化学与生物物理进展》编辑部,亲爱的编辑同志:

贵刊1987年第一期16页上的文章“多胺作为肿瘤诊断指标的可能性”一文提要中提到“本文概述近十余年国内外对多胺的研究”,但正文中通篇见不到关于国内对多胺研究的任何情况;多达30篇的参考文献也全部是外刊,无一篇是国内的。是国内从没发表过此类     

β地中海贫血的基因倍增分析与产前基因诊断

β地中海贫血(简称β地贫)是我国华南和西南地区常见的一组遗传性溶血病,目前尚无满意的治疗方法。重型β地贫患儿病情严重,往往在幼年夭折。用现代分子生物学技术开展基因分析与产前基因诊断。避免β地贫基因纯合子胎儿的出生,是控制β地贫的有效措施。以往的基因分析是对限制性片段多态性构成的单体型进行间接连锁分析,有许多家系无法诊断。     

苯丙氨酸脱氨酶cDNA在大肠杆菌中的克隆与表达及酶法合成L-苯丙氨酸

利用基因重组技术 ,在大肠杆菌中克隆并表达苯丙氨酸脱氨酶 (PAL) (EC4 .3 .1 .5) ,并应用此酶转化肉桂酸生成L 苯丙氨酸。方法是将欧芹苯丙氨酸脱氨酶cDNA亚克隆到组成型表达载体pMG3 6e启动子P3 2下游 ,以菌落PCR法鉴定插入片段的大小和方向都正确的克隆 ,进而以HPLC检测肉桂酸浓度的方法鉴别重组质粒有催化肉桂酸生成L 苯丙氨酸的酶活力。结果获得能表达PAL酶活性的阳性克隆 ,在pH1 0 ,含 1 .0 %肉桂酸、8.0mol/L氨的转化液中 ,3 0℃反应 2 0h ,肉桂酸重量转化率可达 60 %。该基因工程菌有希望用于工业化生产L 苯丙氨酸。     

用PCR法直接快速筛查重组阳性克隆

应用ＰＣＲ法快速筛查插入有苯丙氨酸脱氨酶ｃＤＮＡ重组阳性克隆。方法：用于ＰＣＲ扩增的引物是位于载体ｐＥＴ２３ｂ启动子处的Ｔ７启动子引物和位于目的基因ＰＡＬｃＤＮＡ３’端终止密码ＴＡＡ处的引物。以灭菌吸头挑一单菌落加入ＰＣＲ体系扩增。结果：在筛查的３个克隆中,有２个阳性克降,并且插入方向正确,经ＤＮＡ序列测定得到进一步证实。结论：以ＰＣＲ方法筛查重组阳性克隆,可以简便快速鉴定插入片段的大小和方面,不     

欧芹苯丙氨酸脱氨酶cDNA在乳酸乳球菌中的表达研究

将欧芹（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍｃｒｉｓｐｕｍ）苯丙氨酸脱氨酶（ＰＡＬ）ｃＤＮＡ亚克隆到组成型表达载体ｐＭＧ３６ｅ启动子Ｐ３２下游,电穿孔法转化乳酸乳球菌,获得有ＰＡＬ表达活性的乳酸乳球菌工程菌（ｐＭＧ３６ｅＰＡＬ／Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３）。通过递归ＰＣＲ合成了一段１２０ｂｐ的调控片段,用以将ｐＭＧ３６ｅ改造为分泌型表达载体ｐＸＨＳ,以翻译偶联的方式表达ＰＡＬ,可使ＰＡＬ的Ｎ末端带上ｕｓｐ４５信号肽,结果亦检测到ＰＡＬ酶活性。自行分离克隆了乳酸乳球菌热休克蛋白基因ｄｎａＪ的启动子区域,构建了热诱导表达载体ｐＸＨＪ,获得ＰＡＬ热诱导表达工程菌（ｐＸＨＪＰＡＬ／Ｌ．ｌａｃｔｉｓＩＬ１４０３）,经３０℃至３７℃热诱导,可使ＰＡＬ表达活性提高至２倍。本文还就乳酸乳球菌ＰＡＬ工程菌在经典型苯丙酮尿症防治中的应用进行了分析和讨论     

用直接测定基因组DNA序列的方法检测β-地中海贫血基因突变

本文报道一种结合聚合酶链反应(PCR)技术直接测定基因组DNA中单考贝基因片段序列的方法,以及利用这种方法测定两例β-地贫纯合子的β珠蛋白基因序到结果。测定出基因点突变,一例为编码子17(A→T)突变纯合子,另一例为编码子69(G→A)突变纯合子。针对上述两个点突变合成寡核苷酸片段,末端标记~(82)P后为探针进行斑点杂交的结果与测序结果一致。