黑曲霉阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达

【目的】实现黑曲霉来源的阿魏酸酯酶在毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)中的组成型表达。【方法】以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板,经重叠延伸PCR扩增得到阿魏酸酯酶基因(AnfaeA),将其与载体pGAP9K相连,构建重组表达载体p GAP9KAnfae A,经SalI线性化后电转入毕赤酵母GS115中,得到重组菌株。高效液相色谱法测定发酵液中阿魏酸酯酶活力,并对重组菌进行了发酵优化。【结果】克隆得到783 bp的阿魏酸酯酶编码基因并实现了其在毕赤酵母中的组成型表达。重组菌发酵84 h后,上清液中酶活达5.72±0.10 U/m L。重组酶(reAnfaeA)经分离纯化后比酶活为59.75 U/mg,大小约为40 k D。发酵优化结果为:葡萄糖40.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,酵母膏30.0 g/L,CaCO_3 0.2 g/L,种龄28 h,接种量3%(体积比),装液量50 m L/250 m L。在此条件下发酵培养,酶活达15.60±0.23 U/m L。【结论】阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达,对研究毕赤酵母组成型表达系统和阿魏酸酯酶的发酵生产具有一定的借鉴意义。     

腺苷酸脱氨酶在乳酸克鲁维酵母中构建表达

【目的】实现鼠灰链霉菌来源经密码子优化后的腺苷酸脱氨酶基因在乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis GG799)中组成型表达。【方法】以鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)来源的腺苷酸脱氨酶(AMP)基因经密码子优化后作为模板,设计特异性引物,PCR扩增AMP脱氨酶基因opt-AMPD,以p KLAC1为载体构建重组表达质粒p KLAC1-opt-AMPD,经Sac II线性化后电转化法转入K.lactis GG799,筛选得到重组菌株,测定酶活,经His TrapTM HP纯化后得到AMP脱氨酶,并优化重组菌的发酵培养基。【结果】对AMP脱氨酶基因进行了密码子优化后,构建了重组K.lactis GG799/p KLAC1-opt-AMPD,实现组成型表达,密码子优化后AMP脱氨酶酶活提高到586±50 U/m L。SDS-PAGE结果显示,纯化后的AMP脱氨酶为单一条带,蛋白大小约为60 k D。优化的发酵培养基为(g/L):葡萄糖40、蛋白胨20、酵母粉15、Na Cl 8、KCl 10、Mg SO4 2,30°C、200 r/min发酵120 h,酶活达到2 100±60 U/m L。【结论】实现了密码子优化后的腺苷酸脱氨酶基因在乳酸克鲁维酵母GG799内的组成型表达,为实现腺苷酸脱氨酶的重组高效表达和发酵生产进行了有益探索。     

解脂耶氏酵母脂肪酶基因lip1的克隆、密码子优化及功能表达

摘要：【目的】克隆解脂耶氏酵母（Yarrawia lipolytica）脂肪酶基因lip1,并通过密码子优化,首次实现其在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的诱导型和组成型表达。【方法】通过PCR扩增Y. lipolytica脂肪酶基因lip1,根据P. pastoris密码子偏爱性,运用重叠延伸PCR合成改造后基因MLip1,将其分别克隆至诱导型分泌载体pPIC9K和新构建的组成型分泌载体pGAP9K上,电转至P. pastoris GS115中,G418抗性筛选得到高拷贝转化重组子,摇瓶发酵     

酵母表面展示分选酶底物用于分选酶活性检测

摘要：【目的】以EGFP标签检测分选酶底物QALPETGEE在毕赤酵母表面的表达,然后将酵母表面展示的底物与分选酶相互作用以检测分选酶活性。【方法】以pcDNA-myc-his-EGFP为模板,通过PCR技术将QALPETGEE-linker-EGFP基因连接到穿梭载体pKFS上,构建QALPETGEE-linker-EGFP酵母表面展示载体后转化至毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中。重组菌经培养,利用荧光显微镜检测重组酵母的荧光强度,然后通过荧光分光光度计检测分选酶与底物相互作用后产     

里氏木霉Cel5A基因优化及其在毕赤酵母中的高效表达

内切纤维素酶Cel5A缺乏是限制纤维素酶制剂高效酶解天然纤维素的关键因素。本文尝试构建高效表达里氏木霉Cel5A的毕赤酵母重组菌株以弥补目前Cel5A的天然分泌不足,通过基因密码子偏好性优化里氏木霉Cel5A基因和构建表达载体p PIC9K-eg2,并将其电转入毕赤酵母GS115以构建重组子,利用浓度梯度平板和摇瓶发酵筛选获得一株高产毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115-EGⅡ。重组酶的酶学性质分析显示,该酶分子量50 k Da、最适p H(p H 4.5)略有降低及最适反应温度为60℃,专一性地作用于非结晶纤维素,与天然里氏木霉Cel5A并无明显区别。通过摇瓶发酵的初步优化,该菌摇瓶培养条件:培养温度28℃、起始p H 5.0、接种量2%、每24 h添加甲醇1.5%(V/V)、每24 h添加山梨醇4 g/L及吐温80添加4 g/L,发酵192 h重组酶酶活达到24.0 U/m L。进一步上罐(5 L)发酵180 h,该重组酶Cel5A酶活高达270.9 U/m L,蛋白含量达到4.16 g/L。重组毕赤酵母P.pastoris GS115-EGⅡ是一株适合于外源表达Cel5A的工程菌,该重组酶可替代天然分泌Cel5A适用于当前酶基生物炼制模式下木质纤维素基质高效水解中。     

嗜热棉毛菌木糖苷酶Xyl43基因优化及其在毕赤酵母中高效表达

【目的】通过外源表达手段构建重组毕赤酵母实现木糖苷酶的高效表达。【方法】基于毕赤酵母密码子偏好性优化嗜热棉毛菌β-木糖苷酶(Xyl43)基因密码子,将其导入毕赤酵母GS115中实现分泌表达,并对重组木糖苷酶酶学性质进行分析。通过单因素实验优化高产菌株的摇瓶发酵条件,并在5 L发酵罐中进行扩大培养。【结果】Xyl43基因优化后的序列中222个碱基发生改变,G+C含量由52.8%降低到44.6%,序列一致性为78.17%;将构建的表达载体p PIC9K-Opt Xyl43电击转入毕赤酵母中,利用平板初筛和摇瓶复筛获得一株高效表达重组菌(命名为P.pastoris GS115-Xyl43);其所产重组木糖苷酶大小为51.5 k D,动力学参数Km为2.93 mmol/L、Vmax为157.9μmol/(min·mg),最适反应温度55°C,最适p H 7.0,在p H 6.0-9.5条件下具有良好的稳定性;摇瓶优化结果表明:培养基初始p H 6.0、甲醇补加浓度1.0%、培养温度28°C、摇床转速250 r/min为最佳产酶条件,在此条件下发酵144 h胞外酶活达到42 U/m L(蛋白含量0.54 g/L);5 L发酵罐放大培养,发酵156 h(甲醇诱导96 h),木糖苷酶酶活为222.2 U/m L,蛋白含量2.36 g/L,较摇瓶提高了4.3倍。【结论】木糖苷酶在毕赤酵母中实现了高效表达,具有较好的工业化应用前景。     

甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

采用PCR的方法,以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis基因组 DNA 为模板,克隆出甘露聚糖酶MAN的成熟肽编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pPIC9K-MAN。重组质粒线性化后用聚乙二醇法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株MAN22。将此菌株在5 L发酵罐中进行高密度发酵,测定酶活最高达1102IU /mL,同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。     

毕赤酵母中外源表达脂肪酰-CoA还原酶生产脂肪醇

【目的】通过在毕赤酵母Komagataella pastoris GS115中外源表达来源于霍霍巴[Simmondsia chinensis(Jojoba)]的脂肪酰-Co A还原酶Jojoba FAR,利用微生物发酵生产脂肪醇。【方法】以质粒p RL105为模板PCR扩增获得霍霍巴脂肪酰-Co A还原酶的编码基因,以p GAPZαA为载体构建重组表达质粒p GAP-far,并通过电转化法转入K.pastoris GS115,筛选转化子并发酵,气相色谱-质谱联用检测发酵产物。【结果】构建了毕赤酵母重组菌株p GAPZ-far-GS115,通过摇瓶发酵检测到脂肪醇的合成。随后在7 L规模的发酵罐上发酵验证,得到脂肪醇产量为134.74 mg/L,产率为1.22 mg/(L·h)。【结论】实现了脂肪醇在毕赤酵母中的生物合成,为工业上利用毕赤酵母生产脂肪醇奠定了一定基础。     

烟曲霉脯氨酰内肽酶在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达与重组酶性质

【目的】研究烟曲霉脯氨酰内肽酶cDNA基因的异源表达及重组酶性质。【方法】以烟曲霉CICIM F0044总RNA为模板,反转录合成cDNA;再以cDNA为模板,通过PCR扩增去除自身信号肽的脯氨酰内肽酶基因,构建表达载体pPIC9K-PEP;电转化酵母宿主菌Pichia pastoris GS115,获得重组菌PEP-09;纯化并分析重组酶性质。【结果】重组菌摇瓶发酵酶活力最高可达647.3 U/L。表达产物纯化后的分子量为63 kD左右。重组酶最适反应温度为65°C,有较好的温度稳定性,在55°C保温8 h能保留90%以上的酶活力。该酶最适pH为5.5,在pH 3.0 9.0范围内有很好稳定性,在pH 6.0 8.0的缓冲液中37°C保温10 d酶活没有明显变化。【结论】烟曲霉脯氨酰内肽酶cDNA基因在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌表达,重组酶活性稳定,有一定的应用潜力。     

里氏木霉内切-β-葡聚糖酶Ⅱ基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

采用外显子拼接的方法,以里氏木霉Trichoderma reesei基因组 DNA 为模板,克隆出内切-1,4-β-D-葡聚糖酶II基因egl2的全编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pQY2025。重组质粒线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达内切葡聚糖酶II的毕赤酵母工程菌株Gp2025。用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,培养基中内切葡聚糖酶II的活力可达1573.0U/mL,同时对重组内切葡聚糖酶II的性质进行了初步研究。     

用GAP启动子在毕节酵母中组成型表达人血管抑制素

为探索用GAP启动子(PGAP)取代AOX1启动子(PAOX1),在毕节酵母(P．pastortis)中组成型表达外源蛋白的可能性,应用PCR方法从P．pastoris染色体中扩增了GAP启动子,以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的PAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9K。将人血管抑制素(AS)基因重组于pGAP9K的多克隆位点,获得含As基因的重组质粒pGAP9K-AS。转化P．pastorisGSll5,对获得的高拷贝转化子P．pastorisGSll5(pGAP9K-AS)进行组成型表达,同时以诱导型转化子P．pastoris GSll5(pPIC9K-AS)作为对照。SDS-PAGE结果显示：组成型转化子于培养4d后AS的表达水平已达到高峰,分泌量为58mg／L;而诱导型转化子诱导4d后表达的AS仅是组成型表达的70％,诱导6d后达到高峰,表达量也只是组成型表达系统表达高峰时(4d)的86％。CAM分析和抗癌实验结果显示：P．pastortis GS115(pGA．P9K-S)和P．pastoris GS115(pPIC9K-AS)表达的AS均具有抑制血管生成和C57BL／6J实验小鼠的B16黑色素瘤的生长,其平均瘤重抑制率分别达到90．61％和90．54％。以上结果表明,以GAP启动子构建的组成型表达系统具有发酵时间较短、表达水平较高、不用甲醇诱导、操作系统比较简单等优点,PGAP可以取代PAOX1在P．pastoris中表达AS及其他外源蛋白。     

利用Sed1p锚定蛋白在毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶及其应用

通过PCR扩增米黑根毛霉脂肪酶基因,在米黑根毛霉脂肪酶N端加入Flag标签。将米黑根毛霉脂肪酶基因与酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p基因的N端融合构建质粒pPIC9K-Flag-RML-Sed1,转化毕赤酵母GS115获得重组菌GS115/pPIC9K-Flag-RML-Sed1。重组菌经过甲醇诱导表达后,显微镜免疫荧光分析与流式细胞仪检测结果均证实米黑根毛霉脂肪酶已经成功展示在毕赤酵母上。该重组菌水解活力达到169.6U/g(Dry cell weight),在非水相中催化脂肪酸甲酯的合成,72h后脂肪酸甲酯的产率达82.36%。     

费希尔曲霉脂肪酶在毕赤酵母中的优化表达及高密度发酵

【背景】脂肪酶广泛应用于纺织、食品、药品、皮革等工业领域,其在微生物中的异源表达研究进一步促进了脂肪酶产品的生产和应用。【目的】实现来源于费希尔曲霉的脂肪酶在毕赤酵母中的高效异源表达,探究其合适的表达及发酵条件,提高产量,降低成本。【方法】对费希尔曲霉的脂肪酶编码基因进行密码子优化后,应用pPIC9k质粒整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建高产脂肪酶Lip605的毕赤酵母工程菌;并通过响应面发酵条件优化、筛选最适伴侣蛋白和高密度发酵相结合的方法,综合提高脂肪酶表达量。【结果】确定高产脂肪酶毕赤酵母工程菌的最优摇瓶发酵产酶条件为:甲醇3.103%(体积比),生物素0.4 mg/L,酵母粉11.5 g/L,酵母基础氮源培养基(yeast nitrogen base,YNB) 13.4 g/L,初始pH 6.4,装液量50 mL/250 mL,转速220 r/min,温度24°C,培养时间40 h。优化后的胞外脂肪酶酶活达到72.34 U/mL,较优化前提高了5.8倍;进一步选择12个伴侣蛋白分别与脂肪酶Lip605进行共表达,其中共表达伴侣蛋白Rpl10(pPICZA-RPL10)效果最佳,可使Lip605表达量进一步提高46.8%;在此基础上,经过10 L发酵罐分批补料的高密度发酵,工程菌株发酵142 h,胞外脂肪酶酶活最高达到680 U/mL,蛋白浓度为15.89 g/L。【结论】应用复合策略有效提高了脂肪酶Lip605在毕赤酵母中的发酵产量,为其进一步工业化生产奠定了良好的基础。     

乳酸菌素Gassericin T基因的人工合成及其组成型表达载体的构建

目的:为了研究乳酸菌素Gassericin T的作用机制及应用价值,人工合成Gassericin T基因并构建能高效表达外源蛋白的毕赤酵母组成型表达载体。方法:应用PCR方法从毕赤酵母染色体中扩增GAP启动子,经测序正确后与已线性化的不含pAOX1启动子的毕赤酵母诱导型表达载体pPIC9K连接,转化大肠杆菌DH5α。根据Gassericin T的基因序列,把Gassericin T的结构基因gatA的密码子转换成毕赤酵母偏爱的形式,设计了6条59nt的寡聚核苷酸引物,通过3次连续PCR反应,人工合成gatA片段(简称gat基因),经测序正确后插入pGAP9K质粒的多克隆位点。结果:用GAP启动子(pGAP)取代了pPIC9K上的pAOX1,构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAP9K;PCR拼接获得250bp的目的基因序列,将目的基因克隆于pGAP9K,获得组成型表达载体pGAP9K-gat。结论:为下一步在毕赤酵母中组成型表达外源蛋白,研究其作用机理和遗传机制奠定了基础。     

Intracellular expression and purification of the Canstatin-N protein in Pichia pastoris

Canstatin-N DNA fragment amplified from human genome was inserted into the MCS of pGAP9K*, an intracellular expression vector of Pichia pastoris, to generate pGAP9K*-can-N which was then transformed into P. pastoris GS115 by electroporation. A transformant was chosen as an engineering strain from the plate containing G418 (700 μg/ml). D-sorbitol was selected as the only carbon source. The fermentation was carried out in a 50 L bioreactor at a 20 L working volume. After 48 h fermentation with continuous feeding of 25% (w/v) D-sorbitol and 0.8% PTM4, the cell grew to A(600)=178 and intracellularly expressed Canstatin-N reached 780 mg/L. Snail enzyme was combined with water to crack P. pastoris and to release intracellular proteins. The purified recombinant Canstatin-N inhibited CAM angiogenesis and induced significant apoptosis of the human umbilical vein endothelial cell (EVC340).     

Gassericin T基因的合成及其组成型表达载体的构建

目的:构建Gassericin T基因毕赤酵母(Pichia pastoris)组成型表达载体。方法:根据乳酸菌素Gassericin T的基因序列,把Gassericin T的结构基因gatA编码的氨基酸的密码子转换成P.pastoris偏爱的形式,设计了6条59nt的寡聚核苷酸引物,通过3次连续PCR反应,获得了250bp左右的gat A片段(简称gat基因)。应用PCR方法从P.pastoris染色体中扩增了GAP启动子,大小为500bp左右,以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的pAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9K。将合成的gat基因克隆到pGAP9K质粒的多克隆位点中。结果:获得的gat及gap基因与预期结果一致,序列无碱基突变,构建的表达载体pGAP9K-gat经PCR、酶切鉴定完全正确。结论:成功构建了Gassericin T基因P.pastoris组成型表达载体,为下一步高效表达Gassericin T蛋白,进一步研究其作用机理及应用价值打下基础。     

应用双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母GS115中的表达量

为实现人胰高血糖素样肽-1-人血清白蛋白融合蛋白 ((GLP-1A2G)2-HSA,简称GGH) 的规模化制备,通过pPICZαB与pPIC9K双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母中的表达量。首先运用PCR技术扩增出融合蛋白GGH的基因片段,构建了表达质粒pPICZαB-ggh,并电转至经载体pPIC9K-ggh异位整合的GGH分泌型菌株——毕赤酵母GS115/F2;然后采用免疫学方法并结合高浓度抗生素筛选获得高产菌GS115/F3,在30 ℃,3％甲醇诱导80 h后GGH的表达量达到了491 m     

玉米赤霉烯酮降解酶多拷贝毕赤酵母菌株的构建及高效表达

通过密码子优化、体外多拷贝构建实现玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)降解酶基因(zlhy-6)在毕赤酵母GS115菌株中的高效表达。按酵母密码子偏好性优化zlhy-6基因的密码子,与α因子信号肽编码序列一起合成,插入到pAO815质粒中,通过酶切酶连构建含1–6个表达盒的表达质粒,将其转入毕赤酵母GS115菌中,获得ZEN降解酶重组菌株。重组蛋白分子量为28.9 kDa,与预期一致。重组菌用甲醇诱导3 d,蛋白浓度达最高,之后下降;在pH 5.0、4.5条件下诱导培养,表达量最高;每天添加0.8%的甲醇、接种量10%表达水平最高;4拷贝的转化子表达水平最高,三角瓶发酵3 d,酶活性达到10 U/mL。在1 g玉米渣中添加0.1–0.5 mL发酵上清液,水解24 h,玉米渣中ZEN的降解率为44.08%–75.51%。研究结果为ZEN降解酶工业生产及在食品饲料中的应用奠定了基础。