人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在CHO细胞中的表达

干扰素α2b(interferonα2b,IFNα2b)是一种用于病毒性疾病和肿瘤性疾病治疗的多功能细胞因子,因其在体内的半衰期短限制了其在临床上的应用。将IFNα2b连接到人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的C端,构建融合蛋白HSA-IFNα2b。构建含融合蛋白的真核表达质粒p MH3/HSA-IFNa2b,经电转的方法转入中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞中。经G418抗性压力筛选和目的蛋白的表达量筛选,最终获得一株高表达的稳定细胞株(CHO/p MH3/HSA-IFNa2b)。表达的目的蛋白经Western blot验证显示,产物具有IFNα2b和HSA的双抗原性。经悬浮驯化稳定后,通过批次筛选得到一株稳定的高克隆表达株,产量约为65mg/L,进一步选取高表达克隆株在悬浮驯化中不同代数进行批次培养,不同代数之间蛋白质的表达量和生长情况没有明显的差异,获得一株稳定遗传表达的单克隆细胞株,3L摇瓶的流加培养结果显示,最佳发酵时间为15天,蛋白质表达量为121mg/L。经离心获得的发酵液,经两步纯化后获得蛋白质纯度高达96.8%的目的蛋白,总回收率为22.3%。参照《中国药典》2015版对IFNα2b的检测方法,结果显示,CHO表达的HSA-IFNα2b比活性为4.16×106IU/mg。首次将HSA-IFNα2b在哺乳动物细胞CHO中构建表达,表达获得高活性的HSA-IFNα2b融合蛋白。     

重组人α2b型干扰素的纯化与鉴定

采用单克隆抗体亲和层析一步纯化法对大肠杆菌表达的重组人a2b型干扰素(IFN－α2b)进行了纯化,然后利用凝胶过滤高压液相层析、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳和N端25个氨基酸的序列测定等方法对纯化产品进行了鉴定,表明一步纯化的IFN—α2b达到95%以上的纯度,其比活性为2．54×10⁸U／mg但重组IFN—α2b产品N端不均一,含有约30％的去Met分子和约70％的带Met分子。从蛋白质序列的水平上证实,本实验室用定位诱变法构建的IFN—α2b基因在大肠杆菌系统中得到了正确的表达。     

胸腺素α1/干扰素α-2b融合基因表达载体的构建与表达

通过PCR人工合成模板的方法获得牛Tα1基因,与含IFNα-2b基因的pAG-IFN重组质粒,构建Tα1/IFNα-2b融合基因重组质粒pUC18-Tα1/IFN,经序列分析证实,融合基因Tα1和IFNα-2b与GenBank登录基因的序列一致性分别为100%和98.5%,仅IFNα-2b有两处碱基发生无义突变.再将融合基因亚克隆入pBV220,构建融合表达载体pBV220-Tα1/IFN,转化到E.coli M15经IPTG诱导,实现了Tα1-IFNα-2b融合蛋白的高表达,约占菌体总蛋白的24.5%,为包涵体形式.这为研制Tα1-IFNα-2b双重活性的融合蛋白奠定了基础.     

重组人干扰素λ1的表达、纯化及生物活性研究

目的:利用大肠杆菌系统表达重组人Ⅲ型干扰素λ1(rhIFN-λ1),并进行纯化,以比较其与重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)生物学活性的差异。方法:密码子优化的rhIFN-λ1基因与pET-44a载体连接构建原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物经系列层析纯化;采用细胞病变抑制法比较纯化的rhIFN-λ1与rhIFN-α2b、市售rhIFN-λ1的抗病毒活性;采用MTS法比较这些干扰素的抗肿瘤细胞增殖活性。结果:基因优化后的rhIFN-λ1在大肠杆菌中得以高效表达,用所建立的纯化工艺可制备得到纯度达95.7%的rhIFN-λ1;rhIFN-λ1的抗病毒比活性为3.2×105 U/mg,比市售rhIFN-λ1的比活性(1.1×105 U/mg)略高,抗肿瘤细胞增殖活性为rhIFN-α2b的1.7倍。结论:获得的rhIFN-λ1具有剂量依赖的抗病毒活性和抗增殖活性,其抗病毒活性比市售rhIFN-λ1略高,抗细胞增殖活性高于rhIFN-α2b,提示rhIFN-λ1有较大的应用前景。     

重组人干扰素α2b的制备研究

为了获得高活性高纯度的rh IFNα2b,对重组人干扰素α2b进行克隆、表达,并深入研究了其纯化工艺。采用重叠延伸PCR法合成了编码IFNα2b的基因,用DNA重组技术构建了原核表达载体p BV220-IFNα2b,获得了稳定的工程菌种。发酵产物通过破菌、洗涤获得包涵体,再经过变性、复性、离子交换层析和凝胶过滤层析的纯化,得到rh IFNα2b纯品,其比活可达1×10~8IU/mg。实验结果为进一步开展临床前研究和长效制剂奠定了基础。     

一种人新型基因工程干扰素rh-IFNα-m的高效表达、纯化和活性检测

为实现干扰素 (IFNα m)的高表达与纯化 ,研究其抗病毒、抗增殖活性。应用PCR技术将已构建的IFNα m的高表达基因亚克隆到原核表达载体pBV2 2 0上 ,构建表达质粒 pBV2 2 0 /IFNα m ,转化大肠杆菌DH5α进行表达。表达产物经初步检定以包涵体形式存在 ,包涵体进行变性、复性 ,然后经CM Sepharose FF、DEAE Sepharose FF离子交换层析和Sephacryal HR10 0分子筛纯化 ,获得较纯的干扰素IFNα m。以IFNα 1b为对照 ,在VSV Wish系统上采用细胞病变抑制法 ,测定纯品IFNα m的抗病毒活性。在Hela细胞上用MTT法进行抗增殖实验。结果表明包涵体含量占菌体总蛋白 4 0 % ,纯化的目的蛋白IFNα m纯度在 95 % ,比活高达 1 2 6× 10 7IU/mg ,纯化收率34 4 % ,IFNα m抗病毒活性和IFNα 1b相当 (P >0 0 5 ) ,抗增殖活性高于IFNα 1b(P <0 0 1)。     

甲醇酵母分泌表达重组人干扰素α1b纯化工艺的建立

建立适合大规模、低成本生产重组人干扰素α1b(Recombinanthumaninterferon α1b ,rhIFN α1b)的纯化工艺。采用高效分泌表达rhIFN α1b的甲醇酵母工程菌发酵 ,收集离心后的上清液 ,超滤脱盐 ,经离子交换柱和分子筛柱层析纯化。纯化的rhIFN α1b的纯度为 98%以上 ,比活性 2 .4× 10 7IU/mg ,活性回收率 14 % ,相对分子质量 1980 0和等电点 5 .0。经检测 ,rhIFN α1b蛋白N 端 15个氨基酸序列与正常对照完全符合。该纯化工艺简便 ,时程短 ,重复性好 ,适合于大规模生产     

人干扰素α2b和IgG Fc片段融合蛋白显著延长体内半衰期

重组人干扰素α(rHuIFNα)已被广泛用于临床治疗多种人类病毒性疾病和肿瘤。但IFNα在体内半衰期较短从而导致IFNα在用药后数小时即从血浆中被清除。目前常用化学修饰和构建融合蛋白的方法来延长IFNα的半衰期。在本研究中, 构建了IFNα2b与人IgG免疫球蛋白Fc片段的融合基因(IFNα2b-Fcγ)并在毕赤酵母中以二聚体形式分泌表达, 并有部分糖基化。不同亚型Fcγ片段的融合蛋白对IFNα2b抗病毒活性均有一定影响。其中IFNα2b-Fcγ2所受影响最小, 较单纯的IFNα2b降低了2.3倍, 抗病毒活性可达4.29x107 IU/mg, 大鼠皮下注射后循环血液中半衰期达65 h, 血液中存留时间120 h以上, 比商品重组干扰素的体内半衰期延长约8倍, 血液存留时间延长10倍, 显示了其良好的临床应用 前景。     

胸腺素α1与复合α干扰素融合蛋白的表达及其生物学活性

实验旨在获得具有双重生物学活性的重组胸腺素α1(Thymosin alphal,TM-α1)与复合α干扰素(IFNα-con)融合蛋白.选择大肠杆菌偏爱的密码子.将合成的TM-α1与IFNα-con编码序列构成的融和基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-22b( )、在宿主茵BL21(DE3)-Codon plus-RP-X中成功表达了可溶性融合蛋白(TM-α1.IFN-con).表达量占总蛋白的20%以上.通过硫酸铵沉淀、疏水层析,阴离子交换层析、阳离子交换层析,分子筛层析后,产品纯度达到96%以上.采用细胞病变抑制法测定融合蛋白的抗病毒活性,采用细胞增殖实验检测融合蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响.结果表明.融合蛋白的抗病毒活性优于市售的IFNα1b和IFNα2a.对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响与市售的合成胸腺素α1相同.已有研究证实.该融合蛋白具有良好的体外抗HBV作用.其体外抗HBV活性比联合应用TM-α1和干扰素α强,且细胞毒性明显低于联合应用TM-α1和干扰素α,以上结果表明,通过大肠杆菌表达的可溶性融合蛋白(TM-α1.IFN-con).既具有良好的干扰素α抗病毒作用.也具有胸腺素α1促淋巴细胞增殖作用.     

一种重组人α1型干扰素突变体IFN-α1/86D的纯化与鉴定

本文研究了重组人α1型干扰素突变体IFN-α1/86D在摇瓶培养和分批发酵培养的重组大肠杆菌DH5α株中的表达动态,并采用阳离子交换层析和抗α1型干扰素单克隆抗体亲和层析的两步流程对其进行了纯化,得到SDS-PAGE纯及高效液相层析(HPLC)纯的IFN-α1/86D产品,共比活性为2.3×10~7单位/毫克蛋白。N端氨基酸序列测定的结果表明,纯化产品的纯度在95％以上,但其N端不均一,产品中含有两种N端序列正确的IFN-α1/86D活性分子,即约75％为去Met分子和约25％为带Met分子。     

干扰素α-2b的聚乙二醇修饰

采用分子量为20 kD的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰重组人干扰素α-2b(IFN α-2b),建立了修饰反应及分离纯化工艺.考察了修饰反应各因素对单修饰转化率以及单修饰产物体外活性的影响,获得了优化的修饰反应条件,即在pH 6.5,20 mmol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中,干扰素α-2b的浓度为4 mg/mE,PEG与IFN α-2b的摩尔比为8:1,4℃时反应20 h;在优化的反应条件下,单修饰PEG-IFN α-2b的转化率达到55%.并且,采用离子交换层析对修饰产物进行分离纯化,单修饰产品纯度达到97%,体外活性保留达到未修饰干扰素α-2b的13.4%,其在SD大鼠体内的循环半袁期得到了较大的延长,且具有较好的水溶液稳定性.     

人干扰素IFNα-2b在果蝇细胞中的稳定表达

以人干扰素IFNα-2b全长基因的质粒为模板,PCR扩增,PCR产物克隆到表达载体获得重组质粒,经转染和筛选,得到稳定表达的果蝇S2细胞株.经CuSO4诱导表达并对表达产物进行检测,结果显示,在果蝇S2细胞中成功地进行了人干扰素IFNα-2b的蛋白表达,表达产物的大小约为26kD.并且,通过体外的抗病毒活性测定,证明所表达蛋白具有抗病毒活性.该研究为进一步利用该系统表达真核细胞蛋白,研究其结构和功能提供了重要的基础.     

用国产单克隆抗体纯化重组干扰素α1b的研究

制备高纯度的重组干扰素α1b的关键技术是单克隆抗体亲和层析。我们过去用英国Celltech公司提供的抗干扰素α单克姓抗体珠进行纯化。为适应大规模生产的需要,我们用安科生物高科技公司所建的杂交瘤细胞分泌的干扰素单克隆抗体及其制备的抗体珠进行纯化,获得较好的结果,纯化IFNα1原液纯度（SDS－PAGE,HPLC,比活）,鼠IgG及单克姓抗体珠的吸附量,使用次数等均符合要求,并用于大规模生产。     

人干扰素α—2b生产工艺的研究

人干扰素α-2b的简易、高效生产工艺研究,包括高效率、小型化的发酵技术,不用单克隆抗体亲和层析的纯化工序,以及大肠杆菌表达的人干扰素α-2b包涵体蛋白的天然构型复性等问题,从10L基因工程大肠杆菌发酵液所得1000g菌体中得人干扰素α-2b约500mg,效价为1×10~8u/mg,设备投资少,生产成本低,产品表现了高纯度、高效价。适宜大量生产,为广大人民群众提供廉价高质量药品创造了条件。     

HIV-1gag/IFNα-2b的构建与表达鉴定

目的：构建艾滋病病毒核心蛋白(gag)与干扰素(IFNα-2b)融合基因表达质粒,观察其在痘苗病毒中共表达结果,研究其意义。方法：利用基因重组技术,将IFNα-2b基因片段插入到gag基因的nt531位点,经脂质体转染与血凝素阴性蚀斑筛选,挑出重组痘苗病毒。经免疫荧光、Western blot和Dot-ELISA鉴定表送产物。结果：间接免疫荧光实验结果显示,转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。免疫印迹实验与Dot-EILSA结果均显示重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的gag／IFNα-2b蛋白。结论：成功地构建了重组真核细胞表达质粒,表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性。     

HIV-1gag/IFNα-2b表达产物的生物活性研究

目的:将艾滋病病毒核心蛋白(gag)与干扰素(IFNα-2b)融合基因表达的融合蛋白作为免疫原免疫小鼠,动态观察小鼠的体液免疫、细胞免疫与CTL应答.方法:将IFNα-2b基因片段插入到gag基因的nt531位点,经脂质体转染与血凝素阴性蚀斑筛选,挑出重组痘苗病毒.经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.以小鼠为实验对象,用重组痘苗病毒vJ38gag/IFNα-2b免疫小鼠,用ELISA方法检测血清IgG抗体含量.用流式细胞仪测定小鼠外周血CD+4、CD+8T淋巴细胞计数.3H-TdR掺入法检测细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性.结果:血清IgG抗体含量逐渐增高,实验组与对照组比较差异有显著性意义(p＜0.05).CD+4、CD+8T淋巴细胞计数、CTL检测实验组与对照组比较差异均有显著性意义(p＜0.05).结论:重组痘苗病毒vJ38gag/IFNα-2b能增强小鼠的体液免疫、细胞免疫和CTL应答.IFNα-2b可以作为免疫佐剂增强机体的免疫状态.     

人血清白蛋白和人干扰素α2b的融合蛋白在毕赤酵母中的表达

为了延长IFNα2b在血浆中的半衰期,构建了编码HSA和hIFNα2b的融合基因并在毕赤酵母中获得高效表达,工程菌经5L发酵罐培养后获得的含融合蛋白的培养液经超滤浓缩、蓝色葡聚糖凝胶层析、疏水柱层析以及阴离子柱层析,融合蛋白的纯度达到95%以上。该融合蛋白能与干扰素抗体和人血清白蛋白抗体结合,并表现出与重组干扰素α2b相似的抗病毒活性。以猕猴为动物模型,分别从静脉和皮下单剂量给药,给药浓度为90μg/kg时,在336h后血浆中仍可检测到融合蛋白。其静脉注射的血浆半衰期为101h,皮下注射的半衰期为68.2h。皮下注射的生物利用度为67.9%。IFNα2b与HSA融合后,明显的延长了血浆半衰期,显现了其良好的临床应用前景。     

集成干扰素突变体Ⅱ的分子构建、表达及提纯

目的：通过定点突变,构建集成干扰素突变体Ⅱ（IFN-Con-m2）,以期获得兼具高效作用和可定点聚乙二醇（PEG）修饰的新型药物分子。 方法：采用PCR体外定点突变技术,使集成干扰素突变体Ⅰ（IFN-Con-m1）基因的第86位密码子由TAC突变为TGC。将扩增片段克隆入pET-23b表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。IPTG诱导后,表达的IFN-Con-m2经包含体变复性、疏水层析、DEAE层析和凝胶过滤层析等纯化后,用WISH-VSV系统进行生物活性测定。 结果：IFN-Con-m2以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,IFN-Con-m2的纯度大于95%,比活性大于5.0×108IU/mg。 结论：构建了IFN-Con-m2的表达载体,并成功地在大肠杆菌中表达,获得了高活性突变分子IFN-Con-m2,建立了IFN-Con-m2的纯化工艺。     

重组人干扰素α2b栓剂稳定性研究

研究重组人干扰素α2b栓剂的稳定性。方法将重组人干扰素α2b栓在不同温度下保存不同时间,分别检验干扰素生物学活性、溶出度试验、融变时限、pH和微生物限度及外观的稳定性。结果重组人干扰素α2b栓在4~8℃条件下放置当时和放置48个月后的IFN生物学活性基本一致,未见下降;在20~25℃条件下放置24个月后IFN生物学活性未见下降,放置32个月后活性下降32%,36个月后IFN生物学活性下降55%;37℃条件下放置4个月后IFN生物学活性未见下降。结论重组人干扰素α2b栓剂的生物学活性及理化性质的稳定性好。     

重组人肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素αA(IFNαA)融合蛋白的构建及表达

本文采用定位诱导缺失突变技术,经137个单核苷酸缺失,将串联的重组人肿瘤坏死因子(rhTNF)和重组干扰素αA(rhIFNaA)基因融合成编码单一蛋白的基因。融合基因在大肠杆菌表达后,活性检测证实,存在一旣具有TNF抗肿瘤、又具有IFN抗病毒双重活性的蛋白质。融合蛋白的活性较TNF和IFNαA分别低24倍和15倍。分子筛分析证实,融合蛋白分子量大于25kD。