在大肠杆菌中表达有活性的人STK11蛋白

STK11蛋白(serine/threonine kinase11)是近年来发现的具有多种重要功能的蛋白,可参与调控细胞周期、p53介导的细胞凋亡、ras诱导的细胞转化、细胞极化等多种生物学过程。利用大肠杆菌高效表达有活性的人STK11蛋白,可为其结构和功能的深入研究打下良好基础。利用本室克隆的人STK11 cDNA和原核表达载体pET-44a( )构建带有Nus融合标签的诱导型表达载体pET-Nus-STK11,在不同的大肠杆菌宿主中诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检测表明,在BL21(DE3)宿主中表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的8.9%;在Rosetta-gami(DE3)pLysS宿主中主要表达为可溶性蛋白,占菌体总蛋白的16.7%。而经纯化和包涵体蛋白复性处理后,以Chariot介导重组融合蛋白进入人肝癌细胞SMMC-7721检测其对细胞生长和细胞周期的影响。与对照组相比,BL21(DE3)中表达的Nus-STK11蛋白几乎无抑制活性;而Rosetta-gami(DE3)pLysS中表达的Nus-STK11蛋白可以显著抑制SMMC-7721细胞的生长,抑制率达47.05%,并导致细胞周期的G0/G1期阻滞,证实表达的重组融合蛋白具有明显的生物学活性。上述结果为在大肠杆菌中成功表达有活性的重组STK11蛋白的首次报道。     

重组人蛋白激酶CK 2α亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶 CK2 α亚基 c DNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,IPTG诱导后获特异高效表达 ,表达蛋白占菌体总蛋白的 30 % ,但大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物依次进行 DE- 5 2、P1 1磷酸纤维素和肝素 - Sepharose柱层析分离 ,最后从 30 9mg可溶性蛋白质中得到 6.1 mg纯化蛋白 . SDS- PAGE显示纯化的蛋白质为一分子量 4 2 k D的单一蛋白带 .Western- blot的结果证明 :纯化的表达产物与抗人 CK2α抗体可发生特异性免疫反应 . CK2α和β亚基等摩尔分子混合可组成有完全活性的全酶 .重组的 CK2全酶的性质和功能与该酶的已知特性一致 .这些结果证明重组蛋白是人蛋白激酶 CK2 α亚基     

重组人CK2β亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶CK2β亚基cDNA的重组质粒, 转化大肠杆菌BL21 (DE3), 在IPTG诱导下表达. 表达蛋白大多数以不溶形式存在. 6L(约10.2 g)表达菌抽提得到约20 mg的可溶性表达产物, 通过P11磷酸纤维素一步层析分离, 得到6.8 mg纯化蛋白. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示纯化的蛋白为一分子质量26 ku的单一蛋白带.蛋白质印迹结果证明：纯化的表达产物与抗人CK2β抗体可发生特异性免疫反应. CK2β亚基对CK2α有激活作用, 纯化的CK2α和β亚基在等摩尔混合时即可组成有最大生物活性的全酶. 实验结果有力地证明了克隆表达与纯化的重组蛋白是人蛋白激酶CK2β亚基.     

TAT-hEGF融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中高效自我表达

为了获得TAT-hEGF融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达,构建了原核表达载体pRSET-tat-hegf,将其转化E.coliBL21(DE3)得到重组工程菌BL21(DE3)/pRSET-tat-hegf。工程菌在无IPTG的诱导下实现了高效表达,TAT-hEGF融合蛋白的表达量占总菌体蛋白的45.6%,主要以包涵体形式存在。     

大肠杆菌发酵生产重组人颗粒溶素

目的:在FUS-50L生物反应器中利用补料分批培养技术培养表达含重组质粒pET28a( )-GNLY的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS株,生产重组颗粒溶素(GNLY)。方法:选取含pET28a( )-GNLY的BL21(DE3)pLysS菌株单个克隆分级培养,将制备的二级种子液接种于发酵罐中。在发酵过程中,控制溶氧为30%～50%,温度为37℃;在基础培养基内生长4h后,补加以甘油为碳源的补料,继续生长到11h;加入葡萄糖至终浓度为1%,30℃诱导表达6h;收集菌体,纯化制备目的蛋白。利用Western印迹检测重组蛋白的抗原性,用CFU方法检测其生物学活性。结果:发酵液中最终菌体密度达80g/L;纯化所得重组蛋白约占菌体总蛋白的5%,含量为60mg/L;经鉴定所获重组颗粒溶素有较好的免疫学活性和生物学活性。结论:用含重组质粒pET28a( )-GNLY的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达系统,可得到具有生物活性的重组颗粒溶素,为大批量生产提供了条件。     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

表达猪瘟病毒保护性抗原E0蛋白用以建立猪瘟抗体诊断方法,在标记疫苗(Marker vaccine)的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能,对于监测猪瘟病毒的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用.将猪瘟兔化弱毒株(HCLV)E0基因分别插入原核表达质粒pGEX4T,pET30,pMAL-p2X中,并分别以BL21和BL21-codonplus(DE3)-RP, BL21(DE3)和BL21-codonplus(DE3)-RP,TB1和BL21-codonplus(DE3)-RP为表达菌株.通过摸索IPTG诱导浓度,诱导温度,菌体收获时间,确定E0基因能在pGEX4T/ BL21-codonplus(DE3)-RP和pMAL-p2X/ BL21-codonplus(DE3)-RP中获得高效表达,表达产量分别占菌体总蛋白的15%和30%,表达的重组蛋白主要为包涵体形式.分别采用B-per试剂和超声波裂解配以曲通尿素对包涵体进行洗涤两种方法在pGEX表达系中取得了较好的效果.使用分步透析法对变性的包涵体进行复性,将复性蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-E0融合蛋白.以GST-E0融合蛋白为诊断抗原,通过摸索抗原包被浓度,抗体血清稀释倍数初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清E0抗体的方法,为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定基础.     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

表达猪瘟病毒保护性抗原E0蛋白用以建立猪瘟抗体诊断方法,在标记疫苗(Marker vaccine)的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能,对于监测猪瘟病毒的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用.将猪瘟兔化弱毒株(HCLV)E0基因分别插入原核表达质粒pGEX4T,pET30,pMAL-p2X中,并分别以BL21和BL21-codonplus(DE3)-RP, BL21(DE3)和BL21-codonplus(DE3)-RP,TB1和BL21-codonplus(DE3)-RP为表达菌株.通过摸索IPTG诱导浓度,诱导温度,菌体收获时间,确定E0基因能在pGEX4T/ BL21-codonplus(DE3)-RP和pMAL-p2X/ BL21-codonplus(DE3)-RP中获得高效表达,表达产量分别占菌体总蛋白的15%和30%,表达的重组蛋白主要为包涵体形式.分别采用B-per试剂和超声波裂解配以曲通尿素对包涵体进行洗涤两种方法在pGEX表达系中取得了较好的效果.使用分步透析法对变性的包涵体进行复性,将复性蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-E0融合蛋白.以GST-E0融合蛋白为诊断抗原,通过摸索抗原包被浓度,抗体血清稀释倍数初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清E0抗体的方法,为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定基础.     

辛德毕斯病毒E2包膜蛋白可溶性表达条件的优化

目的:通过优化表达条件,提高辛德毕斯病毒E2包膜蛋白胞外区的可溶性表达量。方法:构建含E2基因胞外区的重组表达质粒pGEX-6p-1-E2,筛选合适宿主菌和诱导温度,并构建5种分子伴侣共表达系统(即pG-KJE8、 pGro7、pKJE7、 pG-Tf2和pTf16 5种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒pGEX-6p-1-E2共表达),筛选最适分子伴侣质粒。结果:(1)E2蛋白的表达量在E.coli BL21、BL21 (DE3) pLysS、Rosetta (DE3)及Origami B (DE3) 4种表达菌中没有明显差别;(2)16℃诱导时E2蛋白在上清中可溶性表达量最高;(3)分子伴侣质粒pG-Tf2使目的蛋白的可溶性表达量提高了15.7%,作用最为显著。结论:通过优化表达条件及使用分子伴侣共表达系统提高了E2蛋白的可溶性表达,为进一步E2蛋白的相关研究奠定了基础。     

表达抗α毒素单链抗体基因工程菌株的构建

将 2种抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 (ScFv)基因ScFv 2E3和ScFv 1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET 2 0b ,pET 2 8a和pHOG2 1中 ,构建了重组质粒 ,分别转化至相应的受体菌JM10 5 ,BL2 1(DE3)和XL1 BLUE中 ,得到表达ScFv的重组菌株。ELISA和SDS PAGE分析检测表明 :经IPTG诱导后所表达的ScFv目的蛋白主要形成了包含体的形式 ,但也有少量ScFv存在于重组菌株的培养上清和胞周质中。经薄层扫描分析 :重组菌株XL1 BLUE (pHOG 2E3)的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的 4% ,重组菌株XL1 BLUE (pHOG 2E3)的蛋白表达产物占菌体总蛋白的相对含量为 2 2 % ,其相对分子量约为 31ku。表达的ScFv蛋白不但具有中和卵磷脂酶的活性 ,而且能够对致死性腹腔攻击α毒素的小鼠产生良好的被动保护作用     

烟草曲茎病毒复制蛋白基因的原核表达和免疫定位

利用PCR方法从烟草曲茎病毒 (TbCSV)Y35分离物的病株中获得复制蛋白 (Rep)基因 ,将其克隆到原核表达载体pGEX 4T 1上获得重组质粒pGEX Y35Rep。重组质粒导入大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中 ,IPTG诱导表达后发现部分Rep融合蛋白以可溶性形式表达。利用GST Sepharose 4B亲和层析柱纯化了Rep的融合蛋白 ,免疫家兔获得Rep蛋白的抗体。对TbCSV侵染烟草中Rep蛋白的亚细胞分布研究发现 ,Rep蛋白主要分布于含有细胞核的组份中。利用免疫胶体金技术对感病烟草中Rep蛋白进行了定位 ,发现Rep蛋白存在于细胞核内     

具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的含硒单链抗体酶制备

 利用RT PCR从分泌有谷胱甘肽结合部位的单克隆抗体杂交瘤细胞株 2F3中 ,扩增出单抗重链可变区和轻链可变区基因 .经DNA测序后 ,用Linker(Gly4 Ser1) 3 构建成单链抗体 (scFv)表达载体pTMF scFv ,将重组质粒pTMF scFv转化到大肠杆菌BL2 1(DE3) ,实现了单链抗体的高效表达 .表达的单链抗体占菌体总蛋白 2 5%～ 30 % .该重组蛋白以包涵体形式存在 ,分子量为 30kD .经过金属螯合亲和层析纯化、复性和凝胶过滤纯化 ,得到电泳均一的单链抗体 .再经化学诱变 ,得到含硒单链抗体酶 ,其谷胱甘肽过氧化物酶活性为 330 0U μmol.采用荧光滴定法测定了单链抗体对谷胱甘肽的结合常数     

IL-1023-57-PE40分泌表达的初步研究

将IL-1023-57-PE40基因与pelB信号肽融合置于pET-20b构建分泌表达质粒pET-20b-IL-1023-57-PE40,然后将pET-20b-IL-1023-57-PE40分别转化至BL21(DE3),BL21(DE3)pLysS,Rosetta(DE3),E·coliK12TB1,ER2566中。无论是在37℃或是在26℃,亦或在培养基中添加葡萄糖的情况下,IPTG诱导后,IL-1023-57-PE40蛋白只在BL21(DE3)pLysS菌中以可溶分泌形式表达,其中以37℃时培养基中不添加葡萄糖表达量为最高,占菌体蛋白总量的15%,说明蛋白的分泌表达与菌种的选择有关。表达产物经免疫印记检测可被抗PE40的特异抗体识别。通过质粒稳定性实验证明,pET-20b-IL-1023-57-PE40在BL21(DE3)中不稳定,导致蛋白的不表达,在Rosetta(DE3)BL21,E·coliK12TB1,ER2566中稳定但不表达,因此,以Rosetta(DE3)BL21为例,通过SDS-PAGE、DNAStar和ANThewin蛋白分析软件对本室构建的几种PE重组毒素进行比较分析,我们发现:并不是所有PE重组毒素融合信号肽序列后,就能分泌表达,PE重组毒素分泌表达还可能与导向部分的性质有关。     

结核分枝杆菌H37Rv 色氨酸合成酶α亚基编码基因的克隆、表达及酶学性质分析

目的 克隆表达色氨酸合成酶α亚基编码基因并对其进行功能分析。方法 以结核分枝杆菌( 简称结核杆菌)H37Rv 基因组为模板, 扩增trpA 基因, 构建pET30a-trpA 重组质粒; 转化重组质粒到大肠埃希菌DH5α并在BL21( DE3) 诱导表达, 纯化可溶性的结核杆菌重组色氨酸合成酶α亚基( His-rMtTrpA) 。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE) 和质谱分析测定相对分子质量( Mr) 后, 用圆二色光谱( CD) 分析和同源模建方法检测二级和三级结构。研究不同浓度HisrMtTrpA对β亚基酶活反应的影响。结果 成功克隆了813 bp 的目的基因trpA, 并获得了高纯度的His-rMtTrpA 蛋白。重组蛋白Mr 为33. 151 ×10³ ( 含载体蛋白) 。25 ℃时His-rMtTrpA 的二级结构包括31. 8% α 螺旋、31. 8% β 折叠、8. 4% β转角和27. 9%无规则卷曲, 它的三维模型显示为( β/ α) 8 桶状结构。酶学性质研究表明, 在His-rMtTrpA 与MtTrpB 的摩尔比为2. 2时, 色氨酸合成酶α亚基可以最大限度促进β亚基酶活反应。结论 成功得到高纯度的重组目的蛋白His-rMtTrpA, 其功能分析为针对色氨酸合成酶的药物筛选设计提供理论基础。     

T7启动子作用下抗人TNF-α单链抗体的表达

基因工程技术构建的抗人TNF-α单链抗体克隆入表达载体pET15b-Etag中,在T7启动子的作用下,经0.1 mmol/L IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,其表达量占菌体总蛋白的38%.表达产物大部分以包涵体形式存在,而一小部分以有活性的可溶性形式出现于细菌的外周质中.这部分可溶性的表达产物占菌体总蛋白的6%,经双抗体夹心法和斑点印迹分析表明它具有抗原结合活性.     

人C反应蛋白在不同原核表达载体及菌株中的表达及免疫反应性分析

构建人C反应蛋白(CRP)原核表达载体,并分别将其转化进入E.coli BL21(DE3)和Rosetta gami 2(DE3)p Lys S中,诱导CRP重组蛋白的表达;主要运用了基因工程,亲和层析及透析复性等方法。成功构建了CRP原核表达载体及菌株。经IPTG诱导后,得到了不同的重组CRP蛋白。结果表明,相同表达载体在不同的表达菌株中的表达情况有一定差别,分别在大肠杆菌及Rosetta gami2(DE3)p Lys S中表达并得到了重组CRP的包涵体,对复性后的CRP重组蛋白进行Westen blotting及ELISA检测,结果表明原核表达的重组CRP蛋白的免疫反应性很低,CRP蛋白发挥免疫活性需要以五聚体形式存在。     

重组B群脑膜炎球菌fHBP融合蛋白的表达和免疫原性研究

采用PCR构建编码B群脑膜炎球菌fHBP蛋白V<,1>变异型全长序列和V<,2>变异型C结构域抗原表位融合蛋白的基因片段.并克隆入pET30a<'(+)>载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在其实现表达,表达量约占菌体蛋白总量的30%.表达产物经离子交换层析纯化后,获得了纯度达到90%以上的融合蛋白.将融合蛋白免疫小...     

硫矿硫化叶菌P2分子伴侣基因的克隆表达及其性质

[目的]研究重组表达的硫矿硫化叶菌P2分子伴侣β亚基体外同源聚合体的结构和生化功能.[方法]利用PCR技术从硫矿硫化叶菌P2的基因组DNA中克隆得到分子伴侣β亚基的基因,将该基因克隆到表达载体pET-21a( )上并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达.对纯化后的β亚基单体进行体外聚合,利用透射电镜观察β分子伴侣的结构,并对其促蛋白折叠性质进行了研究.[结果]硫矿硫化叶菌P2分子伴侣β亚基基因在大肠杆菌BL21中实现了高效表达,纯化后的分子伴侣β亚基单体在ATP和Mg2 存在的条件下可自组装形成分子伴侣聚合体.透射电镜观察表明:该β分子伴侣具有Ⅱ型分子伴侣典型的双层面包圈结构,每个环由8个亚基构成.该β分子伴侣具有ATPase活性,最适反应温度为80℃;它不仅能够促进变性的绿色荧光蛋白(GFP)重新折叠,而且还能有效的提高木聚糖酶的热稳定性.[结论]本文根据P2基因组序列分析预测的分子伴侣基因设计引物,克隆表达了硫矿硫化叶菌P2分子伴侣的β亚基,纯化后对其进行体外聚合,透射电镜观察表明该聚合体具有Ⅱ型分子伴侣的经典结构,功能分析表明该β分子伴侣能够在体外促进异源蛋白质的折叠、提高其它酶分子的热稳定性.这为进一步深入研究嗜热古菌耐热抗逆的分子机制,奠定了良好的基础.     

HCV E2区基因在原核系统中的表达

用提取的重组表达载体pET-E2转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,再进行SDS-PAGE,可得到有一条约34 kDa的表达带,与理论推测的蛋白分子量一致,通过Western-blot鉴定,证明此带即为目的蛋白带.该产物有一个六聚组氨酸尾,主要以包涵体形式存在;计算机扫描分析考马斯亮兰染色后的蛋白胶显示目的蛋白占整个菌体蛋白的36%以上,经Ni-柱纯化的E2蛋白纯度可达95%以上;以纯化的E2蛋白为抗原,用ELISA方法检测了20份抗HCV阴阳性血清,结果表明15份抗HCV阳性血清中检出5份E2抗体阳性血清,而5份抗HCV阴性血清中没有检测到E2抗体.     

羊抑制素α亚基N端1-33序列肽段多聚体的构建及其表达纯化

为了提高短肽的免疫原性以制备短肽基因工程疫苗 ,将羊抑制素α亚基N端 1-33氨基酸残基片段的基因序列插入表达质粒pRSET A的BamHⅠ \SacⅠ位点之间构建重组质粒pR INH ,然后利用质粒中的一对同尾酶位点BamHⅠ \BglⅡ和下游的另一酶切位点HindⅢ ,经过简单的酶切后 ,将产物按各种组合连接 ,构建了抑制素串联 2至 6聚体基因。含3至6聚体基因的重组质粒pR 3INH、pR 4INH、pR 5INH和pR 6INH经IPTG诱导均能在大肠杆菌 (E .coli)BL21(DE3)中表达目的蛋白 ,分别占菌体蛋白的 6 %、6 %、7%和 8% ,且都以包涵体形式存在。结果说明 ,利用同尾酶切技术可以快速正确地构建短肽片段的串联多聚体重组质粒 ,为构建短肽半抗原的高免疫原性基因工程疫苗提供了新的思路。     

一种新型单链抗体血栓导向显像剂的制备和部分性质研究

 利用对血栓部位活化血小板α 颗粒膜蛋白GMP 140有亲和特异性的单克隆抗体SZ5 1的血栓部位导向作用 ,并利用金属硫蛋白的高金属结合能力 ,在基因工程水平构建分子量适中的单链抗体血栓导向显像剂 .1分子单抗SZ5 1单链抗体 (ScFv SZ5 1)与 1分子小鼠金属硫蛋白 (MT Ⅰ )cDNA的重组基因拼接产物 ,在大肠杆菌菌株BL2 1(DE3)pLysS中进行发酵表达 ,重组蛋白HLMT表达量为 4 0mg L发酵液 .该重组蛋白以包涵体形式存在于菌体中 .通过一种有效的包涵体制备方法可获得目的蛋白含量为 84 %的包涵体沉淀 .在优化的条件进行了包涵体的变复性 ,复性液先后经过Q SepharoseFF阴离子交换层析和SephadexG 5 0凝胶过滤层析进行纯化 .SDS PAGE鉴定了重组蛋白纯度达 95 %以上 .HPLC进一步证明了最终纯化产品的均一性 .质谱测定HLMT分子量为 384 31 3,与理论值基本相符 .等电聚焦电泳测定pI为 3 0 .Western印迹结果表明 ,HLMT中单链抗体部分具有与活化血小板α 颗粒膜蛋白GMP 140结合特异性 .原子吸收分光光度计法 (AAS)证明 ,HLMT中金属硫蛋白保持了原金属结合活性 .重组蛋白HLMT可以进一步进行核素标记实验和动物体内血栓显像实验