猪瘟病毒野毒株持续感染细胞模型的建立

采用猪瘟病毒野毒珠（ＣＳＦＶ３９）感染猪肾传代细胞系ＰＫ－１５,经连续传７９代,建立了稳定的病毒持续感染细胞模型,获得ＣＳＦＶ３９－ＰＫ１５细胞株。用免疫荧光、ＲＴ－ＰＣＲ检测、透射电镜跟踪观察了ＣＳＦＶ３９－ＰＫ１５细胞株连续传代中病毒在细胞内的存在情况。结果表明第９,２９,７９代细胞仍有猪瘟病毒存在,表现出病毒持续感染的基本特征。这为深入研究猪瘟病毒持续感染机理奠定了基础。     

22株猪瘟病毒E2基因部分编码序列的序列分析

RT－PCR方法获得了13株猪瘟病毒分离株、石门系强毒、中国C株及法国温度敏感株Thiverval株的E2基因部分编码序列的拉增片段,并对其进行了测序,得到了251bp的E2基因部分编码序列。利用DNAStar软件对其中224bp的片段进行了序列分析,并与已发表的Alfort、Brescia等毒株进行比较,结果13株猪瘟分离株所测片段均为猪瘟病毒E2基因的序列,与石门系强毒的序列相比所有毒株的碱基替换随机地分布于整个序列,无碱基缺失和碱基插入。其中变化较大的区域位于序列的3′端。2 2株HCV E2基因部分编码序列的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为78.1%-100%、78.4%-100%,其中13株猪瘟病毒流行毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为:78.1%-100%、78.4%-100%,4株70－80年代分离的毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为：79.0%-88.3%、81.1%-87.8%,9株90年代分离的毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为：90.3%-100%、83.8%-100％;说明猪病毒流行株的变异呈现一定的多样性。     

猪瘟病毒野毒株持续感染细胞模型的稳定性研究

以本实验室建立的CSFV39-PKl5持续感染细胞模型为实验材料，综合运用免疫荧光、RT-PCR、流式细胞仪，对其稳定性进行研究。实验结果均表明，该细胞模型有着良好的稳定性。即使在连续传至128代的CSFV39-PKl5传代细胞中，CSFV仍持续存在：呈免疫荧光抗体反应阳性和RT-PCR检测阳性。同时，该细胞与正常的PK-15细胞相比，细胞周期无显著差异。通过同段序列的同源性比较，发现CSFV39与CSFV石门株的同源性最高，达99．02％。     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

表达猪瘟病毒保护性抗原E0蛋白用以建立猪瘟抗体诊断方法,在标记疫苗(Marker vaccine)的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能,对于监测猪瘟病毒的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用.将猪瘟兔化弱毒株(HCLV)E0基因分别插入原核表达质粒pGEX4T,pET30,pMAL-p2X中,并分别以BL21和BL21-codonplus(DE3)-RP, BL21(DE3)和BL21-codonplus(DE3)-RP,TB1和BL21-codonplus(DE3)-RP为表达菌株.通过摸索IPTG诱导浓度,诱导温度,菌体收获时间,确定E0基因能在pGEX4T/ BL21-codonplus(DE3)-RP和pMAL-p2X/ BL21-codonplus(DE3)-RP中获得高效表达,表达产量分别占菌体总蛋白的15%和30%,表达的重组蛋白主要为包涵体形式.分别采用B-per试剂和超声波裂解配以曲通尿素对包涵体进行洗涤两种方法在pGEX表达系中取得了较好的效果.使用分步透析法对变性的包涵体进行复性,将复性蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-E0融合蛋白.以GST-E0融合蛋白为诊断抗原,通过摸索抗原包被浓度,抗体血清稀释倍数初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清E0抗体的方法,为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定基础.     

猪瘟兔化弱毒株E2基因的原核表达及间接ELISA的初步建立

猪瘟病毒E2蛋白C端含有一段30多个疏水性氨基酸组成的跨膜区域(Transmembrane region,TMR),用RT-PCR和巢式PCR分别扩增了含不同长度TMR的猪瘟兔化弱毒E2基因,并克隆入pGEX-4T-1的MCS中,构建了原核表达载体pGEXTE2-339(无TMR)、pGEXTE2-355(1TMR)、pGEXTE2-375(3TMR).因E2基因含有大量大肠杆菌稀有密码子,选择了BL21-CodonPlus(DE3)-RP作为表达受体菌,结果表明pGEXTE2-339、pGEXTE2-355以包涵体的形式正确表达了目的蛋白,而pGEXTE2-375没有明显表达.并利用pGEXTE2-339、pGEXTE2-355表达的融合蛋白初步建立了间接ELISA方法.     

牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品的研制

手足口病是由多种肠道病毒感染导致的一种急性儿科传染病。近年来,我国肠道病毒71型 (EV71) 手足口病发病率急剧上升,重症病例时有报道,严重威胁儿童健康。临床上对于重症手足口病的治疗缺乏有效手段,主要以对症治疗和支持疗法为主。静脉注射人免疫球蛋白由健康献血员血浆提取纯化而来,含有包括EV71在内的多种肠道病毒的中和抗体,可作为重症手足口病被动免疫和免疫调节的重要手段,值得关注。     

猪瘟病毒野毒株持续感染细胞模型的建立

采用猪瘟病毒野毒珠(CSFV39)感染猪肾传代细胞系PK-15,经连续传79代,建立了稳定的病毒持续感染细胞模型,获得CSFV39-PK15细胞株.用免疫荧光、RT-PCR检测、透射电镜跟踪观察了CSFV39-PK15细胞株连续传代中病毒在细胞内的存在情况.结果表明第9,29,79代细胞仍有猪瘟病毒存在,表现出病毒持续感染的基本特征.这为深入研究猪瘟病毒持续感染机理奠定了基础.     

牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品的研制

为制备标定凝集试验用的牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品,采集4份田间自然感染牛布鲁氏菌病的阳性血清作为候选物,经过筛选后,选择了3#血清用于标准品制备。对该标准品进行了物理性状、无菌检验、真空度测定、剩余水分检验、均匀性检测和稳定性试验,检测结果均符合要求。以国际标准品为参比,测定了该标准品的RBT、SAT和CFT效价,结果分别为1∶160“+”、1∶2 400“++”、1∶800“++”,与协作标定结果完全一致。该标准品以国际标准品溯源的国际单位含量为4 000 IU/mL。     

猪瘟病毒野毒株持续感染细胞模型的稳定性研究

以本实验室建立的CSFV39-PK15持续感染细胞模型为实验材料,综合运用免疫荧光、RT-PCR、流式细胞仪,对其稳定性进行研究.实验结果均表明,该细胞模型有着良好的稳定性.即使在连续传至128代的CSFV39-PK15传代细胞中,CSFV仍持续存在呈免疫荧光抗体反应阳性和RT-PCR检测阳性.同时,该细胞与正常的PK-15细胞相比,细胞周期无显著差异.通过同段序列的同源性比较,发现CSFV39与CSFV石门株的同源性最高,达99.02%.