质粒pRSET-A前导肽串联多聚体的构建及其多克隆抗体制备*

质粒pRSET-A是一个常用的高效原核表达载体,编码一N端含组氨酸标签（6×His）的34aa前导肽序列,以方便利用抗组氨酸标签抗体鉴定或纯化所表达的重组蛋白。本实验设计一对两侧含编码疏水性氨基酸密码子的引物,经过扩增前导序列10~34aa基因序列,并重新克隆入质粒pRSET-A构建串联二聚体后,再利用质粒pRSET-A的BamH I / Bgl II同尾酶克隆位点,经一系列简单的酶切和连接,快速构建这一前导肽中不含组氨酸标签序列的串联多聚体基因,并成功表达其六聚体重组蛋白。将此重组蛋白主动免疫山羊,获得了能够特异地识别pRSET-A编码的N端前导肽序列的抗体。结果显示,所制备的羊抗10~34aa前导肽抗体能够识别pRSET-A指导表达的含有完整前导肽的重组蛋白,但不能识别不含10~34aa序列的重组蛋白;同时,利用同位酶技术可以快速高效构建短肽的串联多聚体以制备具有高免疫原性的亚单位疫苗或免疫调控物质。     

羊抑制素α亚基N端1-33序列肽段多聚体的构建及其表达纯化

为了提高短肽的免疫原性以制备短肽基因工程疫苗 ,将羊抑制素α亚基N端 1-33氨基酸残基片段的基因序列插入表达质粒pRSET A的BamHⅠ \SacⅠ位点之间构建重组质粒pR INH ,然后利用质粒中的一对同尾酶位点BamHⅠ \BglⅡ和下游的另一酶切位点HindⅢ ,经过简单的酶切后 ,将产物按各种组合连接 ,构建了抑制素串联 2至 6聚体基因。含3至6聚体基因的重组质粒pR 3INH、pR 4INH、pR 5INH和pR 6INH经IPTG诱导均能在大肠杆菌 (E .coli)BL21(DE3)中表达目的蛋白 ,分别占菌体蛋白的 6 %、6 %、7%和 8% ,且都以包涵体形式存在。结果说明 ,利用同尾酶切技术可以快速正确地构建短肽片段的串联多聚体重组质粒 ,为构建短肽半抗原的高免疫原性基因工程疫苗提供了新的思路。