T7启动子作用下抗人TNF-α单链抗体的表达

基因工程技术构建的抗人TNF-α单链抗体克隆入表达载体pET15b-Etag中,在T7启动子的作用下,经0.1 mmol/L IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,其表达量占菌体总蛋白的38%.表达产物大部分以包涵体形式存在,而一小部分以有活性的可溶性形式出现于细菌的外周质中.这部分可溶性的表达产物占菌体总蛋白的6%,经双抗体夹心法和斑点印迹分析表明它具有抗原结合活性.     

抗人黑色素瘤单链抗体基因的克隆和分泌型表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从分泌抗人黑色素瘤单克隆抗体的杂交瘤细胞ＨＢ８７６０中克隆了抗体轻、重链可变区基因,然后用（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３连接肽基因将ＶＨ、ＶＬ连接成ＳｃＦｖ基因,并进行了序列测定．计算机分析表明ＶＨ,ＶＬ均符合小鼠抗体可变区的特征,为功能性重排的抗体可变区基因．ＶＨ、ＶＬ、ｌｉｎｋｅｒ拼接正确．ＳｃＦｖ基因全长７２９ｂｐ,其中ＶＨ基因长３６０ｂｐ,编码１２０个氨基酸,ＶＬ基因长３２４ｂｐ,编码１０８个氨基酸．在噬菌粒表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中表达了可溶性的ＳｃＦｖ蛋白,表达产物经流式细胞仪检测可特异地与黑色素瘤细胞结合,不与肝癌、胃癌及良性黑痣细胞结合     

抗人AFP抗体噬菌体呈现文库的构建筛选及基因序列测定

从人ＡＦＰ免疫小鼠脾细胞ｍＲＮＡ中扩增出全套抗体Ｖ区基因并随机拼接为ＳｃＦｖ基因,构建全套ＳｃＦｖ基因噬菌体呈现文库,经两轮ｐａｎｎｉｎｇ筛选富集,一次从９４个单个重组噬菌体克隆中筛选到１４个具有ＡＦＰ结合活性的克隆,测定两个阳性克隆中ＳｃＦｖ基因的核苷酸序列,获得一个Ｖ＿Ｈ基因和两个Ｖ＿Ｋ基因,其基因序列分别与鼠ＩｇＶ＿ＨＪ５５８、Ｖ＿ｋ－ＯＸ１和Ｖ＿ｋ４／５家族同源性最高;推导出的氨基酸序列中均含有抗体Ｖ区特征性的两个恒定的半胱氨酸残基、具有明确的三个ＣＤＲ和四个ＦＲ序列,表明这三个基因均系新发现的功能性鼠抗体Ｖ区基因序列。     

抗人AFP抗体噬菌体呈现文库的构建筛选及基因序列测定

从人ＡＦＰ免疫小鼠脾细胞ｍＲＮＡ中扩增出全套抗体Ｖ区基因并随机拼接为ＳｃＦｖ,构建全套ＳｃＦｖ基因噬菌体呈现文库,经两轮ｐａｎｎｉｎｇ筛选富集,一次从９４个单个重组噬菌体克隆中筛选到１４个具有ＡＦＰ结合活性的克隆,测定两个阳性克隆中ＳｃＦｖ基因的核苷酸序列,获得一个ＶＨ基因和两个ＶＫ基因,其基因序列分别与鼠Ｉｇ ＶＨｊＪ５５８,ＶＫ－ＯＸ１和ＶＫ４／５家族同源性最高,推导出的氨基酸序列中均含有抗体     

抗黑色素瘤单链抗体在大肠杆菌中的表达

单链抗体是用一段连接肽将抗体重、轻链可变区连接而成的抗体片段,大小为完整抗体的六分之一。具有分子小,免疫原性低,容易进入实体瘤周围微循环,有很强的肿瘤组织穿透力,血循环和全血廓清快,半衰期短,肾脏蓄积少,无Fc段不易与非靶细胞结合,肿瘤/正常组织分布率高,定位成像时本底低,易于基因操作和大量生产等诸多优点,成为目前基因工程抗     

抗人CD8单链抗体基因的构建

CD8分子分布于部分T淋巴细胞和胸腺细胞。是MHC Ⅰ类抗原的配体,它与MHC Ⅰ类分子结合可以稳定CTL与带有MHC Ⅰ类分子与抗原复合物的靶细胞的结合。近年来已有不少抗CD8的单抗被用于预防及治疗骨髓移植时的移植物抗宿主反应及心、肾移植时的免疫排斥反应,但这些鼠源性单抗应用于人体时,其异源性会引起免疫排斥反应,限制了它的临床应用,因而有必要对鼠源性抗体进行人源化     

T7启动子作用下抗人TNF—α单链抗体的表达

基因工程技术构建的抗人ＴＮＦ－α单链抗体克隆人表达载体ｐＥＴ１５ｂ－Ｅｔａｇ中,在Ｔ７启动子的作用下,经０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ诱导,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中获得高效表达,其表达量占菌体总蛋白的３８％,表达产物大部分以包涵体形式存在,而一小部分以有活性的可溶性形式出现于细菌的外周质中。     

抗人肿瘤坏死因子-α单链抗体与其配体的相互作用

为了在大肠杆菌中表达纯化抗人 TNF- α单链抗体并检测其结合活性与中和活性 .利用GST融合蛋白系统在大肠杆菌中表达抗人 TNF- α单链抗体 E6Sc Fv;分离包含体后进行变性和复性 ,再用亲和层析法进行纯化 ;用 ELISA法和酵母双杂交系统检测 E6Sc Fv与配体的结合 ;用 L92 9细胞检测 E6Sc Fv对人 TNF- α细胞毒作用的中和活性 .经变性 ,复性与亲和层析 ,E6Sc Fv被纯化 ,在 SDS- PAGE上为单一蛋白带 ;体外结合与中和实验表明 ,表达纯化的 E6Sc Fv可与人 TNF-α结合并中和其细胞毒活性 ;进一步用酵母双杂交系统证明当表达于细胞内时 ,E6Sc Fv仍保持了与TNF-α相结合的能力 .