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1.
用PCR方法从海洋单细胞蓝藻聚球藻7002(Synecohococcus sp.PCC7002)基因组DNA中扩增得到藻蓝蛋白β亚基基因(cpcβ)的上游序列(Pcpcβ),及编码谷氨酰胺合成酶的glnA基因片段,以Pcpcβ作为启动子,以glnA基因片段作为整合平台,构建含有小鼠金属硫蛋白-Ⅰ(mMT-Ⅰ)cDNA的同源整合表达载体pKGC-MT,通过自然转化法将整合表达载体导入聚球藻7002中,经氨苄青霉素筛选,得到遗传性状稳定的转基因藻,PCR检测证明mTM-Ⅰ基因已整合到蓝藻基因组DNA上;蛋白质印迹表明mMT-Ⅰ已在蓝藻中表达;ELISA结果显示mMT-Ⅰ在蓝藻中的表达量约为800μg/g。  相似文献   
2.
一种新型单链抗体血栓导向显像剂的制备和部分性质研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
 利用对血栓部位活化血小板α 颗粒膜蛋白GMP 140有亲和特异性的单克隆抗体SZ5 1的血栓部位导向作用 ,并利用金属硫蛋白的高金属结合能力 ,在基因工程水平构建分子量适中的单链抗体血栓导向显像剂 .1分子单抗SZ5 1单链抗体 (ScFv SZ5 1)与 1分子小鼠金属硫蛋白 (MT Ⅰ )cDNA的重组基因拼接产物 ,在大肠杆菌菌株BL2 1(DE3)pLysS中进行发酵表达 ,重组蛋白HLMT表达量为 4 0mg L发酵液 .该重组蛋白以包涵体形式存在于菌体中 .通过一种有效的包涵体制备方法可获得目的蛋白含量为 84 %的包涵体沉淀 .在优化的条件进行了包涵体的变复性 ,复性液先后经过Q SepharoseFF阴离子交换层析和SephadexG 5 0凝胶过滤层析进行纯化 .SDS PAGE鉴定了重组蛋白纯度达 95 %以上 .HPLC进一步证明了最终纯化产品的均一性 .质谱测定HLMT分子量为 384 31 3,与理论值基本相符 .等电聚焦电泳测定pI为 3 0 .Western印迹结果表明 ,HLMT中单链抗体部分具有与活化血小板α 颗粒膜蛋白GMP 140结合特异性 .原子吸收分光光度计法 (AAS)证明 ,HLMT中金属硫蛋白保持了原金属结合活性 .重组蛋白HLMT可以进一步进行核素标记实验和动物体内血栓显像实验  相似文献   
3.
单链尿激酶型纤溶酶原激活剂Kringle结构域催化功能探讨   总被引:1,自引:0,他引:1  
 Kringle(K)结构域广泛存在于与凝血和纤溶相关的各种因子中 .虽然 K结构域在一级结构上是一种比较保守的结构域 (与其他结构域相比 ) ,但是 K结构域的功能在各种因子中的作用有很大的区别 .为探讨单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (scu- PA)的 K结构域功能 ,构建了在 scu- PA的 K结构域的 1 1 8位 Gly与 1 1 9位 Leu之间插入 PRGDWR序列的突变体 (称为 insert mutant B,In B) ,并测定了野生型 scu- PA与 In B的纤溶相关反应的动力学常数 . scu- PA与 In B水解 S- 2 4 4 4反应的 Km 值无明显变化 (分别为 60 .4与 56.8μmol·L-1) ,而 In B的 kcat值 (0 .33s-1)比 scu- PA的 kcat值 (7.31 s-1)降低很多 ;In B激活纤溶酶原反应的 Km 值 (0 .397μmol· L-1)比 scu- PA Km 值(0 .648μmol·L-1)降低 40 % ,但 kcat值 (0 .0 1 65s-1)比 scu- PA的 kcat值 (0 .0 62 6s-1)降低 74% .以上结果说明 :K结构域主要与反应活性相关 ,而与酶及底物的亲和性无关 .  相似文献   
4.
乙烯是植物的一种催熟激素,其合成前体是蛋氨酸(Met),它通过三步反应形成乙烯: 乙烯通过分子克隆与异源系统表达,已鉴定了腺苷甲硫氨酸(AdoMet)合成酶[反应(1)],1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合成酶[反应(2)]与ACC氧化酶[反应(3)]的编码基因。该途径的限制步骤是ACC合成酶催化的反应(2)。应用基因工程的方法已将ACC合成酶、Acc  相似文献   
5.
6.
苜蓿高含硫氨基酸蛋白转基因植株再生   总被引:36,自引:0,他引:36  
通过农杆菌介导法将高含硫氨基酸蛋白基因转入苜蓿,成功地诱导转基因植株再生,转化植株生长和发育良好,苜蓿子叶外植体是较理想的转化受体。冷凉湿润的环境条件是苜蓿移栽成活率高所必需的。  相似文献   
7.
8.
玉米21kD富硫种子贮存蛋白的cDNA克隆及其序列分析   总被引:3,自引:0,他引:3  
利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从玉米掖单-20开花后10d的叶片中分离到21kD玉米种子贮存蛋白cDNA(N21KZY),并进行了序列分析.其编码蛋白包含211个氨基酸,极其富含甲硫氨酸,高达27%;其N端有一个21个氨基酸的信号肽.N21KZY及其编码蛋白和Chui等人分离的该基因的基因组克隆及其编码蛋白的同源性分别为95.1%和90.5%;两者的编码蛋白与玉米10kD醇溶蛋白极其相似,其中间多出一个54氨基酸的肽段和一个6氨基酸的肽段,这表明它们可能是来源于同一个祖先基因,后来通过基因重排、缺失或不均等交换等过程而形成的不同的蛋白质.  相似文献   
9.
一种新的纤溶酶原激活反应动力学研究方法   总被引:2,自引:0,他引:2  
 在溶栓研究中 ,纤溶酶原激活剂 (plasminogen activator,PA)激活纤溶酶原 (plasminogen,Plg)反应的动力学常数的测定占有重要地位 .在前人的研究中 ,虽然进行了这项实验 ,但是并未给出一个方便、快捷的测定方法 .所以建立一种更准确 ,更适合一般的实验室条件的 PA分子激活 Plg反应动力学常数的测定方法是必要的 .在对该反应进行数学分析的基础上 ,得到由可测量表示的纤溶酶 (plasmin,Plm)生成速度 (v(Plm) )的计算公式 ,由 v(Plm)及相应已知量可进一步推导出 Km、kcat的表达式 ,最终测得相应动力学常数 .用这种方法测定的由甲醇酵母 (pichia pastoris)表达的人单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (human single chain urokinase- PA,scu- PA)激活 Plg的反应的 Km=0 .648μmol·L-1,kcat=0 .0 62 6s-1,与文献报导相符 (Km=0 .4~ 1 .1 μmol· L-1,kcat=0 .0 2~ 0 .0 93) s-1,说明此方法是可靠的 .又因该法只需相应底物及酶标仪且为连续测定 ,所以十分简便 .  相似文献   
10.
为了提高小鼠金属硫蛋白-I(mMT-I)在鱼腥藻7120(Anabaena sp.PCC 7120)中的表达量、便于表达产物的分离纯化,构建了新的穿梭融合表达载体pKG-MT。通过pKG-MT,mMT-I cDNA在tac启动子的调控下,以与谷胱甘肽转硫酶(GST)C-末端相融合(GST-MT)的形式在鱼藻中表达。SDS-PAGE结果显示在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下GST-MT在鱼腥藻中表达。经谷胱甘肽亲合层析,从转基因藻中分离、纯化得到GST-MT,利用GSTC-末端的凝血酶酶切位点,用凝血酶对GST-MT进行柱上酶切,经Sephadex G50除去凝血酶得到mMT-I。SDS-PAGE表明纯化得到所要的目标产物;ELISA测定结果显示从每克转基因藻(鲜重)中可纯化得到0.9 mg mMT-I;原子吸收测定表明纯化得到的mMT-I的镉离子结合能力接近于天然MT。  相似文献   
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