单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D在酵母中的表达

从提取的HSV-1基因组中扩增得到编码gD蛋白胞外区1～314aa的基因gDt,将其插入毕赤酵母表达质粒pPIC9K的醇氧化酶(AOX1)启动子下游,构建携带gDt的重组载体,经电转化GS115菌株和G418筛选,得到了高效分泌表达gD蛋白的毕赤酵母菌株,表达量达到250mg/L,该目的蛋白可被gD单抗(1-I-9)特异性识别。表达产物经离子交换、金属螯合、分子筛柱层析纯化后得到纯度较高的重组蛋白。重组gD蛋白免疫BALB/c小鼠可诱生一定水平的特异性抗体,表明该蛋白具有较好的免疫原性,能够诱导小鼠产生体液免疫应答。     

啤酒酵母生产的重组水蛭素的纯化及脱色

对啤酒酵母生产的重组水蛭素变异体1(rHV1)进行多步骤的纯化。首先将分泌到培养上清液中的水蛭素进行硫酸铵沉淀和SephadexG-50凝胶过滤,再用Q-SepharoseHP阴离子交换层析分离,最后用HPLCSP-5PW阳离子交换柱脱色及HPLCC8柱反相层析。真空干燥后得到的水蛭素蛋白经SPS-PAGE、N端氨基酸序列分析、抗凝血酶活力分析鉴定,证明已获得高纯度的重组水蛭素HV1制剂,为利用基因工程方法生产重组水蛭素的规模化生产及临床应用提供了依据     

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D在酵母中的表达

从提取的HSV-1基因组中扩增得到编码gD蛋白胞外区1～314aa的基因gDt,将其插入毕赤酵母表达质粒pPIC9K的醇氧化酶(AOX1)启动子下游,构建携带gDt的重组载体,经电转化GS115菌株和G418筛选,得到了高效分泌表达gD蛋白的毕赤酵母菌株,表达量达到250mg/L,该目的蛋白可被gD单抗(1-I-9)特异性识别.表达产物经离子交换、金属螯合、分子筛柱层析纯化后得到纯度较高的重组蛋白.重组gD蛋白免疫BALB/c小鼠可诱生一定水平的特异性抗体,表明该蛋白具有较好的免疫原性,能够诱导小鼠产生体液免疫应答.     

幽门螺杆菌napA基因在乳酸菌中的表达及免疫原性分析

本实验目的是在乳酸菌中表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori） 中性粒细胞激活蛋白(NAP),口服免疫小鼠后检测其免疫原性。在实验中利用了分子克隆技术构建携带nap基因的重组原核表达质粒pNICE:sec-nap,将重组质粒转化乳酸菌NZ9000株,筛选鉴定阳性菌落,诱导表达的NAP蛋白用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。将雌性ICR（CV级）小鼠随机分为4组,分别用PBS、携带空质粒的乳酸菌、携带pNICE:sec-nap的乳酸菌、灭活的H.pylori 灌胃。免疫7次后检测其特异性IgG和IgA的产生。成功扩增了nap基因并构建了重组原核表达质粒pNICE:sec-nap,转化乳酸菌NZ9000后经nisin诱导可表达Mr约17kDa的重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白量的9.5%,表达的蛋白能与兔抗H.pylori 血清特异性反应,具有良好的免疫原性。携带pNICE:sec-nap质粒的乳酸菌刺激产生的IgG水平明显高于携带空质粒组,与灭活H.pylori组没有明显的差异,但其刺激产生的IgA水平明显高于其他组。以上结果说明表达NAP蛋白的乳酸菌口服免疫小鼠后,能够刺激小鼠产生特异的IgG和IgA,对幽门螺杆菌疫苗的研究开发具有理论的意义。为乳酸菌作为抗原递送载体的研究和H.pylori口服疫苗的开发提供一定的实验基础。     

小肠三叶因子在乳酸菌中的表达

实验目的是在乳酸菌中表达小肠三叶因子(ITF) ,并建立兔子胃溃疡模型,口服观察ITF对胃黏膜损伤的再生作用。在实验中利用了分子克隆技术构建携带ITF基因的重组原核表达质粒 pNICE:sec ITF,将重组质粒转化乳酸菌 NZ9000株 ,筛选鉴定阳性菌落,用nisin诱导表达,表达ITF蛋白通过Tricine SDS-PAGE和 Western blot进行鉴定。将重约2㎏的新西兰成年兔分为对照组,预防组,治疗组,用盐酸诱导胃溃疡模型,预防组在模型建立前用携带 pNICE:sec-ITF的乳酸菌灌胃,对照组,治疗组,在溃疡模型建立后,分别用 PBS、携带pNICE:sec-ITF的乳酸菌灌胃。通过溃疡级别及损伤指数的确定携带 pNICE:sec-ITF的乳酸菌灌胃后对胃黏膜损伤再生的作用。实验成功扩增ITF基因并构建了重组原核表达质粒 pNICE:sec-ITF,转化乳酸菌 NZ9000后经 nisin诱导可表达 Mr约 6.0kDa的重组蛋白 ,表达量约占菌体总蛋白量的 5%。动物实验的预防组和治疗组显示在盐酸诱导胃溃疡模型前和后用携带pNICE:sec-ITF的乳酸菌灌胃,能够促进溃疡黏膜的再生。这对新型的基因工程药物的研究开发具有一定的理论意义,为乳酸菌作为药物递送载体的研究和开发打下一定的实验基础。     

治疗型VP22△-mE6△/mE7重组蛋白疫苗的表达与免疫学初步分析

制备16型人乳头瘤病毒mE6Δ/mE7蛋白与I型人单纯疱疹病毒VP22Δ蛋白的治疗型分子内佐剂融合蛋白疫苗,并检测其免疫原性和抗肿瘤相关生物活性。通过克隆HSV-1 VP22Δ及HPV-16 mE6Δ/mE7基因,构建pET28a-VP22Δ-mE6Δ/mE7原核表达载体。重组质粒在Rosetta（DE3）宿主菌中进行诱导表达,表达蛋白经分离、复性后,通过镍离子亲和层析进行纯化,纯化蛋白经SDS-PAGE、Western blot 鉴定,并免疫BalB/C及C57BL/6小鼠,检测其免疫原性和抗肿瘤活性。结果显示,VP22Δ-mE6Δ/mE7蛋白以包涵体形式表达,分子量约为34kDa,表达量约占菌体总蛋白的45%。该蛋白免疫小鼠后血清特异性IgG、特异性淋巴细胞增殖效果及对TC-1致瘤小鼠的肿瘤治疗效果均高于无佐剂单一重组蛋白疫苗。以上结果说明,所获得的重组融合蛋白具有较好的免疫原性和抗肿瘤活性,为治疗型HPV分子内佐剂疫苗的进一步研究奠定了基础。     

人白细胞介素11的定点聚乙二醇修饰

利用人白细胞介素11（hIL-11）无半胱氨酸（Cys）残基这一特点,通过定点突变将一个Cys残基引入hIL-11的N末端。然后,利用与Cys 巯基特异性反应的mPEG-马来酰亚胺将mPEG偶联到预先选定的位点,经层析纯化得到hIL-11的定点PEG修饰物。利用依赖型细胞株7TD1测定其生物学活性,结果表明,其体外生物学活性保持原有hIL-11活性的30%左右。定点聚乙二醇修饰方法为定向改造hIL-11,提高其药效的应用研究打下基础。     

重组B群脑膜炎球菌fHBP融合蛋白的表达和免疫原性研究

采用PCR构建编码B群脑膜炎球菌fHBP蛋白V<,1>变异型全长序列和V<,2>变异型C结构域抗原表位融合蛋白的基因片段.并克隆入pET30a<'(+)>载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在其实现表达,表达量约占菌体蛋白总量的30%.表达产物经离子交换层析纯化后,获得了纯度达到90%以上的融合蛋白.将融合蛋白免疫小...     

重组人降钙素基因相关肽融合表达及纯化初步研究

采用大肠杆菌偏爱的密码子人工合成hαCGRP基因,构建了原核融合表达载体,对融合蛋白成功地进行了表达、纯化,Western免疫印迹验证该蛋白具有αCGRP抗原性,为下一步hαCGRP纯品的获得及动物实验的研究奠定基础。     

重组人甲状旁腺激素肽（1-34）在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化

人工合成人甲状旁腺激素1-34肽段 (PTH1-34)的cDNA序列,克隆到大肠杆菌蛋白表达载体pThioHis中,获得了高表达菌株。经发酵、破菌、金属鳌合层析、反相层析和凝胶层析后获得了纯度大于95%的hPTH1-34。hPTH1-34肽N端测序和质谱分子量测定结果与天然PTH1-34一致。生物学活性研究表明,hPTH1-34在体外具有刺激腺苷酸环化酶的作用。